【New Technology】双光子激发显微镜（Two-photon excitation microscopy）

双光子激发显微镜（Two-photon excitation microscopy , TPEF或2PEF）是一种荧光成像技术，特别适用于对厚度不超过一毫米的散射活体组织进行成像。与传统荧光显微镜（激发波长短于发射波长）不同，双光子激发需要两个波长长于发射光的光子同时激发。激光聚焦到组织中的特定位置，并在样本上扫描，依次生成图像。由于双光子激发的非线性，主要激发的是激光束微米级聚焦范围内的荧光团，从而提高了图像的空间分辨率。这与共聚焦显微镜不同，共聚焦显微镜的空间分辨率是由激发焦点和针孔的封闭检测相互作用产生的。

双光子激发显微镜通常使用近红外（near-infrared, NIR）激发光，这种光也能激发荧光染料。由于红外光在典型的生物组织中散射较少，因此使用红外光可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收，背景信号被强烈抑制。这两种效应都增加了该技术的穿透深度。双光子激发技术具有更深的组织穿透力、高效的光检测和更少的光漂白，因此是共聚焦显微镜的一种优越替代技术。

Concept

双光子激发利用了双光子吸收，这一概念最早由Maria Goeppert Mayer（1906-1972 年，德裔美国理论物理学家）在1931年的博士论文中描述，Wolfgang Kaiser于1961年利用激光激发在 CaF₂:Eu²⁺晶体中首次观察到这一概念。Isaac Abella于1962年在铯蒸气中证明单个原子的双光子激发是可能的。

双光子激发荧光显微镜（Two-photon excitation fluorescence microscopy）与激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy）和拉曼显微镜（Raman microscopy）等其他激光共聚焦显微镜技术有相似之处。这些技术使用以光栅模式扫描的聚焦激光束来生成图像，并且都具有光学切片效果。与共聚焦显微镜不同的是，多光子显微镜不包含针孔孔径，而针孔孔径赋予了共聚焦显微镜光学切片的质量。多光子显微镜产生的光学切片效果是激发点扩散函数的结果。双光子激发的概念基于这样一种想法，即两个光子（光子能量比单光子激发所需的光子能量低）也能在一个量子事件中激发荧光团。每个光子携带的能量约为激发分子所需能量的一半。发射出的光子比两个激发光子中的任何一个能量更高（波长更短）。几乎同时吸收两个光子的概率极低。因此，通常需要峰值流量较高的激发光子，通常由飞秒脉冲激光产生。例如，与脉冲激光通过双光子效应产生的荧光相比，平均激光功率相同但不产生脉冲的情况下不会产生可检测到的荧光。多光子显微镜的长波长、低能量（通常为红外线）激发激光非常适合用于活细胞成像，因为与通常用于单光子激发的短波长激光相比，这种激光造成的损伤较小，因此可以对活组织进行更长时间的观察，且毒性影响较小。

最常用的荧光团的激发光谱在 400-500 nm范围内，而用于激发双光子荧光的激光器在钛蓝宝石激光器产生的~700-1100 nm（红外线）范围内。如果荧光团同时吸收两个红外光子，就会吸收足够的能量进入激发态。然后，该荧光团将发出一个单光子，其波长取决于所用荧光团的类型（通常为可见光谱）。由于荧光团在激发过程中会吸收两个光子，因此荧光团发出荧光的概率会随着激发强度的增加而呈二次方增加。因此，在激光束高度集中的地方产生的双光子荧光要比激光束较分散的地方多得多。实际上，激发被限制在极小的焦点体积（约 1 飞摩尔- femtoliter）内，从而高度抑制了焦外物体。与单光子激发显微镜相比，这种局部激发是其主要优势，因为单光子激发显微镜需要使用针孔等元件来抑制焦外荧光。样品发出的荧光随后会被光电倍增管等高灵敏度探测器收集。观察到的光强成为最终图像中的一个像素；在样品的整个所需区域内扫描焦点，以形成图像的所有像素。

Schematic representation of the energy levels (Jabłoński diagrams) of the fluorescence process, example of a fluorescent dye that emits light at 460 nm. One (purple, 1PEF), two (light red, 2PEF) or three (dark red, 3PEF) photons are absorbed to emit a photon of fluorescence (turquoise).（荧光过程的能级示意图（Jabłoński 图），以在 460 纳米波长发光的荧光染料为例。一个（紫色，1PEF）、两个（浅红色，2PEF）或三个（深红色，3PEF）光子被吸收后发出一个荧光光子（绿松石色）。）

Optical response from a point source. From left to right: calculated intensity distributions xy (top) and rz (bottom), with logarithmic scale, for a point source imaged by means of a wide field (a), 2PEF (b) and confocal microscopy (c). The 2PEF and confocal forms have a better signal-to-noise ratio than the wide field. The 2PEF distribution is larger due to the fact that a wavelength twice as long as in the case of a wide or confocal field is responsible for the intensity distribution. These intensity distributions are also known as point spread functions. Optical conditions: the excitation wavelengths are 488 nm and 900 nm respectively for 1PEF and 2PEF; the emission wavelength is 520 nm; the numerical aperture is 1.3 with an oil immersion objective.（点光源的光学响应。从左到右：通过宽视场（a）、2PEF（b）和共聚焦显微镜（c）成像的点光源的计算强度分布 xy（上）和 rz（下），对数刻度。2PEF 和共聚焦形式的信噪比优于宽场。2PEF 分布较大，这是因为强度分布的波长是宽场或共焦场的两倍。这些强度分布也称为点扩散函数。光学条件：1PEF 和 2PEF 的激发波长分别为 488 纳米和 900 纳米；发射波长为 520 纳米；数值孔径为 1.3，使用油浸物镜。）

Development

双光子显微镜由康奈尔大学Watt W. Webb实验室的Winfried Denk和James Strickler于1990年首创并获得专利。他们将双光子吸收的理念与激光扫描仪的使用相结合。在双光子激发显微镜中，一束红外激光通过物镜聚焦。通常使用的钛蓝宝石激光器的脉冲宽度约为100飞秒（fs），重复频率约为80 MHz，因此可以获得双光子吸收所需的高光子密度和高光通量，并且可以在很宽的波长范围内进行调谐。

使用红外光来激发光散射组织中的荧光团还有额外的好处。较长波长的光散射程度低于较短波长，这对高分辨率成像有好处。此外，这些能量较低的光子不太可能对焦体外造成损伤。与共聚焦显微镜相比，光子检测更为有效，因为即使是散射光子也能产生可用信号。在双光子激发显微镜发明几年后，人们才认识到在散射组织中成像的这些优点。

使用双光子显微镜有几个注意事项：双光子激发所需的脉冲激光器比共聚焦显微镜中使用的连续波（CW）激光器昂贵得多。分子的双光子吸收光谱可能与单光子吸收光谱有很大不同。高阶光损伤成为一个问题，漂白与激光功率的平方成正比，而单光子（共焦）则是线性的。对于非常薄的物体（如孤立的细胞），单光子（共焦）显微镜由于激发波长较短，可以生成光学分辨率更高的图像。另一方面，在散射组织中，双光子显微镜卓越的光学切片和光检测能力可带来更好的性能。

A diagram of a two-photon microscope.

Applications

Main（主要应用）

双光子显微镜已涉及许多领域，包括生理学、神经生物学、胚胎学和组织工程学。双光子显微镜的高速成像能力还可用于无创光学活检。双光子显微镜已被恰当地用于产生局部化学反应，其效果还被用于基于双光子的光刻技术。利用双光子荧光和基于二次谐波发生的显微镜，研究表明有机卟啉型分子在双光子荧光和二次谐波发生时会有不同的过渡偶极矩，而人们认为这些过渡偶极矩是由相同的过渡偶极矩产生的。

Cancer research（癌症研究）

2PEF还被证明对表征皮肤癌非常有价值。它还能揭示肿瘤细胞停滞、肿瘤细胞与血小板相互作用、肿瘤细胞与白细胞相互作用以及转移定植过程。

Embryonic research（胚胎研究）

在对哺乳动物胚胎进行长期活细胞成像时，2PE比共焦点显微镜等其他技术更具优势。

Kidney research（肾脏研究）

2PEF被用于观察难以接近的细胞类型，尤其是肾脏细胞。它还被用于更好地了解流体动力学和过滤。

Neuroscience（神经科学）

2PEF以及将此方法扩展到3PEF可用于描述活体甚至行为动物大脑中完整神经组织的特征。该方法尤其适用于神经元或神经元群的钙成像、光药理学，包括谷氨酸等成分的局部解笼或光开关药物的异构化以及其他报告神经递质浓度的基因编码传感器的成像。

目前，双光子显微镜被广泛用于对模式生物（包括果蝇（Drosophila melanogaster）、大鼠、鸣禽、灵长类动物、雪貂、小鼠（Mus musculus）和斑马鱼）的神经元活体发射进行成像。由于显微镜和扫描设备的尺寸问题，动物通常被固定在头部，但微型显微镜也正在开发之中，可以对移动和自由活动的动物的神经元进行成像。

Higher-order excitation

所谓的 "三光子激发荧光显微镜"（three-photon excitation fluorecence microscopy, 3PEF）是继双光子激发荧光显微镜（two-photon excitation fluorecence microscopy, 2PEF）之后最常用的技术，是双光子激发荧光显微镜的补充。利用三光子激发光开关药物在体内局部异构化的研究也有报道。

Dyes and fluorescent proteins for two-photon excitation microscopy

一般来说，所有常用的荧光蛋白（CFP-Cyan Fluorescent Protein、GFP-Green Fluorescent Protein、YFP-Yellow Fluorescent Protein、RFP-Red Fluorescent Protein）和染料都可以用双光子模式激发。双光子激发光谱通常要宽得多，因此更难通过切换激发波长来选择性地激发荧光团。

据报道，有几种绿色、红色和近红外发光染料（探针和活性标签）具有极高的双光子吸收截面。由于具有供体-受体-供体型结构，Seta-670、Seta-700和Seta-660等方碱染料与其他染料相比具有极高的双光子吸收（2PA）效率、SeTau-647和SeTau-665是一种新型的方碱-罗汉松烷，在近红外区域表现出极高的双光子作用截面，高达10,000 GM，这是其他任何一类有机染料都无法比拟的。

小结

与传统显微镜不同的是，双光子激发显微镜利用两个光子同时激发样品。这两个光子的能量之和等于激发样品所需的能量，但单个光子的能量却不足以引起样品的激发。这种双光子共同激发的特性使得激发发生的空间更加局限，能够实现更精确的成像，同时减少了对样品的损伤。

双光子激发显微镜技术在生命科学领域有着广泛的应用。它可以用于观察活体样品，如活体细胞、活体小动物等，实现对生物过程的实时观察和研究。同时，由于其较深的穿透深度，双光子激发显微镜还可以应用于观察组织样品的三维结构，探索组织内部的微观结构和功能。

这项先进的显微镜技术为生命科学研究提供了全新的视角和工具，推动了生物学、医学等领域的发展。

END