【精油科学】精油对肝癌细胞的作用

文摘   2024-07-29 20:30   江苏  

世界肝炎日


    肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是目前我国常见的恶性肿瘤, 具有病死率高、 生存周期短、 复发率高等特征, 其5年生存率仅为5.1%, 死亡率高居我国癌症死亡率的第2位。目前, 手术切除、 放疗、 介入、 肝移植、 靶向药物及免疫疗法是治疗肝细胞癌的主要手段, 但均具有一定的局限性, 如手术常要求肿瘤处于早期, 无转移发生;以PD⁃1/PD⁃L1 抑制剂和血管生长抑制为代表的抗肿瘤药物也存在靶点单一等问题。因此, 寻找其他有效的HCC治疗药物具有重要的意义。 

    白术是菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz. 的干燥根茎, 具有益气健脾、 燥湿利水等功效。课题组前期通过超临界CO2 萃取法, 从白术的干燥根茎中提取得 到一种具有特殊香气的黄棕色液体, 即为白术精油 (the essential oil of Rhizoma atractylodis macrocephalae, EO⁃ RAM), 通过HPLC指纹图谱研究, 发现其主要成分有苍术酮、 白术内酯Ⅰ、 白术内酯Ⅲ等, 并且在MHCC97⁃L细胞 和MHCC97⁃L 移植瘤裸鼠模型上证实具有治疗肝癌的活性。其他研究也表明, 白术精油可以通过抑制MMP⁃9表达发挥抑制H22肝癌肺转移的作用。在临床上, 白术也被众多医家用于治疗肝癌, 具有较好的疗效。因此, 本研究拟探索白术精油对HepG2、 MHCC97⁃L 和 M⁃ HCC97⁃H 肝癌细胞凋亡的影响及其作用机制, 以期为白术 的开发、 应用提供一定的理论依据。



研究结果





01

白术精油对肝癌细胞增殖活性的影响

    如图1A所示, 10、 20、 40、 60 μg/mL 白术精油作用 24 h 时, 对 HepG2 细胞无明显抑制作用 (P>0.05);延长到 48、 72 h 时, 10~120 μg/mL 白术精油均能抑制 HepG2 细胞活性 (P< 0. 05), 其中作用48 h半抑制浓度 (IC50 ) 约为80 μg/mL。如图1B 所示, 10、 20 μg/mL 白术精油作用 24 h 时, 对 MHCC97⁃L 细胞无明显抑制作用 (P>0.05);延长到 48、 72 h 时, 10~120 μg/mL 白术精油均能抑制MHCC97⁃L细胞活性 (P<0.05), 其中作用48 h IC50 约为60 μg/mL。如图 1C 所示, 10、 20、 40 μg/mL 白术精油作用24 h时, 对 MHCC97⁃H 细胞无明显抑制作用 (P>0.05);延长到 48、 72 h 时, 40~120 μg/mL 白术精油能抑制 MHCC97⁃H 细胞活性 (P<0.05), 其中作用48 h IC50 约为60 μg/mL。以上结果表明, 白术精油能抑制 HepG2、 MHCC97⁃L 和 MHCC97⁃H 肝癌细胞的增殖并呈现时间和剂量依赖性。综上所述, 本研究选择白术精油的给药质量浓度为40、 60、 80 μg/mL, 作用时间为48 h。


02

白术精油对HepG2、 MHCC97⁃H 肝癌细胞增殖能力的 影响

    如图2所示, 与溶剂组比较, 60、 80 μg/mL白术精油可抑制MHCC97⁃H 细胞增殖能力 (P<0.01), 40、 60、 80 μg/mL 白术精油可抑制HepG2细胞增殖能力 (P<0.05,P<0. 01)。


03

白术精油对HepG2、 MHCC97⁃H 肝癌细胞凋亡的影 响

    Hoechst 33342 实验结果如图 3 所示, 与溶剂组比较, 60、 80 μg/mL 白术精油干预 48 h 后, HepG2、 MHCC97⁃H 细胞内出现亮蓝色的或碎块状的致密浓染, 即细胞呈现凋亡现象, 细胞凋亡率升高 (P<0.01)。进一步采用Annexin V⁃FITC/ PI 双染法和流式细胞仪检测白术精油对肝癌细胞凋亡的影响, 结果如图4所示, 可知与溶剂组比较, 60、 80 μg/ mL 白术精油组HepG2、 MHCC97⁃H细胞出现凋亡现象, 凋亡率升高 (P<0.05, P<0.01), 其中 HepG2 细胞凋亡特征以晚期凋亡为主, 而MHCC97⁃H细胞以早期凋亡为主。以上结果表明, 白术精油能通过诱导HepG2、 MHCC97⁃H 细胞凋亡, 从而抑制肝癌细胞的增殖。


04

白术精油对肝癌细胞Bax、 Bcl⁃2、 cleaved caspase⁃3、 cleaved PARP 蛋白表达的影响

    如图5~6所示, 与溶剂组比较, 60、 80 μg/mL 白术精油组HepG2、 MHCC97⁃H 细胞 Bax、 cleaved caspase⁃3、 cleaved PARP 蛋白表达及Bax/Bcl⁃2 比值升高 (P<0.05, P<0.01)。Western blot、 Hoechst 33342 和流式细胞术结果共同证实, 白术精油能通过促进肝癌细胞凋亡来发挥抑制其增殖的作用。

 


研究结论


    肝细胞癌是最为常见的恶性肿瘤之一, 其死亡率高居世界癌症死亡率的第二位, 且具有复发率高、 生存率低的特点。目前, 针对肝癌早期患者临床中首选手术治疗, 但是确诊时往往已是中晚期, 因此, 选择高效低毒的药物对于肝癌的治疗具有重要作用。中药具有多靶点、 副作用小 等治疗优势, 正得到越来越多的关注。 
    在临床中, 由白术组成的主要方药对胃癌、 肺癌和肝癌等均有一定治疗作用。实验发现, 白术精油可以通过抑制MMP⁃9的分泌, 发挥抑制H22肝癌血道转移模型肺转移的作用。课题组前期在体内外实验中均证实, 白术精油具有治疗肝癌的药效基础。因此, 本研究在此基础上进一步探索白术精油对肝癌的抑制作用及其机制。 
    肝癌细胞的异常增殖是其最典型的恶性生物学特征, 本研究选择HepG2、 MHCC97⁃L、 MHCC97⁃H 肝癌细胞作为 实验对象, 通过MTT实验证实白术精油对这3种肝癌细胞的增殖均有抑制作用, 且具有剂量和时间依赖性。通过 Hoechst33342 实验发现, 白术精油能诱导HepG2、 MHCC97⁃ H 肝癌细胞凋亡, 80 μg/mL效果与阳性药索拉菲尼相当;流式细胞术的结果也证实了白术精油对肝癌细胞凋亡的促进作用。 
    细胞凋亡受到细胞内外多种因子和信号通路的调控, 其中包括线粒体相关的Bcl⁃2、 Bax 蛋白。Bcl⁃2 作为抗凋亡蛋白, 可通过阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质, 从而抑制细胞凋亡;Bax作为一种促凋亡蛋白, 可从细胞质转移至线粒体表面, 与Bcl⁃2结合成异源二聚体, 从而抑制 Bcl⁃2 活性, 发挥促进细胞凋亡的作用, 因此, 常用Bax/ Bcl⁃2 比值的变化来反映细胞凋亡情况。此外, Caspase家族成员参与细胞生长、 分化、 凋亡等生理过程, 其中 caspase⁃3 是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶, 具有促进细胞凋亡的作用。PARP 也是死亡家族的调控因子之 一, 其中被切割的PARP, 即cleaved PARP 被认为可以激 活caspase⁃3, 从而诱导细胞凋亡。本研究发现, 白术精油作用48 h 后, HepG2、 MHCC97⁃H 肝癌细胞 Bax/Bcl⁃2、 cleaved caspase⁃3、 cleaved PARP 蛋白表达均升高, 且呈现剂量依赖性。综上所述, 白术精油对肝癌细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导肝癌细胞凋亡来实现的, 这对于今后它作为治疗肝癌联合用药或单独开发用药提供一定的理论依据。

文章原作:

1. 广州中医药大学第二附属医院

2.粤港澳中医药与免疫疾病研究联合实验室

3.广州中医药大学第二附属医院中药药理研究实验室

李红霞1,叶泽婷2#,聂裕桐3,
苏祖清1,2,3∗,郑广娟1,2,3∗

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