【精油科学】精油抑制真菌及真菌毒素的科学依据

文摘 2024-06-17 20:30 浙江

植物精油及其活性成分的抑菌作用

植物精油抑制真菌生长和真菌毒素合成

近年来，国内外有关植物精油抑制真菌生长及真菌毒素积累的研究较多，见表1。Rajaram等研究发现藿香蓟精油能有效抑制寄生曲霉菌生长和4种黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的合成。在固态培养基中，精油质量分数为1.5 g/kg 时，能够完全抑制寄生曲霉菌的生长；在液态培养基中，精油质量浓度为0.75 g/L时，可完全抑制霉菌的生长，且质量浓度为0.5 g/L时，对黄曲霉毒素合成的抑制率高达84%。Passone等研究发现波尔多树精油接触法和熏蒸法的体积分数分别为 1.5 mL/L 和 2.0 mL/L 时，能完全抑制炭黑曲霉的生长；丁香精油接触法的体积分数为1.5 mL/L时，能够完全抑制炭黑曲霉的生长，熏蒸法的抑菌浓度因水分活度（aw）不同而有所差异；在aw 0.98、 0.93 时，2 种精油均能达到较好的抑菌作用，其抑制率分别为14.7%和 78.5%，二者在 OTA 的生物合成途径中具有抑制作用。Yamamoto-Ribeiro等研究发现生姜精油对轮状镰刀菌的最小抑菌浓度为2.5 mg/mL，随着精油浓度的增大，菌丝体的生物量在不断减少，当质量浓度分别为 3.0、5.0 mg/mL 时，可完全抑制 FB2和 FB1的生物合成。Marín 等研究发现在aw 0.950、30 ℃时，牛至、玫瑰草和香茅精油均能显著抑制ZEA的合成；在 aw 0.995、30 ℃时，肉桂、丁香、牛至、玫瑰草和香茅精油均能有效抑制DON的产生，表明植物精油对真菌毒素合成的抑制作用可能与水分活度和温度有一定的关系。

植物精油活性成分抑制真菌生长和真菌毒素合成

植物精油的化学成分较为复杂，一种精油中往往含有十多种至上百种化学成分，其中一些主要的化学成分可能决定植物精油的抑菌活性。袁媛等研究发现丁香酚可以有效抑制黄曲霉菌的生长及 AFs的产生，柠檬醛和丁香酚均能有效抑制禾谷镰刀菌的生长及DON的积累，且将2种活性成分应用到染菌玉米中熏蒸培养，发现在玉米含水量为 21%时，对DON合成的抑制率分别为98.33%和 95.64%。Luo等研究发现月桂酸甘油酯对黑曲霉菌和灰绿青霉菌的最小抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为0.32、0.16 g/L及2.50、0.63 g/L，其抑菌作用显著高于食品防腐剂山梨酸钾和苯甲酸钠。张宽朝等采用天然肉桂醛、柠檬醛作为抑菌剂，比较牛津杯法、气体扩散法对黑曲霉生长的影响。结果显示，肉桂醛、柠檬醛作用于黑曲霉后，均具有明显的抑菌效果，黑曲霉菌丝体和孢子囊的形态结构均发生了变化，且柠檬醛作用要显著大于肉桂醛，2 种成分的气体扩散法抗黑曲霉效果均优于牛津杯法。研究发现，在抑制真菌活性方面具有开发潜力的植物精油成分主要包括醛类（肉桂醛、柠檬醛、橙花醛、香茅醛、茴香醛），酚类（麝香草酚、丁香酚、百里香酚、香芹酚），醇类（芳樟醇、香茅醇、薄荷醇）和酮类（香芹酮、薄荷酮），均有较强地抑制真菌生长及真菌毒素合成的作用。

植物精油及其活性成分的广谱抑菌性

研究表明植物精油及其活性成分均具有广谱的抑菌活性，见表2。Naeini等研究发现药用植物野蔷薇、孜然、小茴香、松、白梭梭精油对10种不产毒镰刀菌（茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌）和11种产毒镰刀菌（串珠镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌）多种真菌生长的完全抑菌浓度的平均值分别为 165.4和88.9 μg/mL、159和185.3 μg/mL、496.4和 532.9 μg/mL、869.7和852.43 μg/mL、753.5和1 492.6 μg/mL。其中，野蔷薇对11种产毒菌显示出最好的抑制活性，孜然对10种不产毒镰刀菌真菌的抑菌效果最显著，小茴香和松的抑菌效果次之，白梭梭的抑菌活性最低。Kumar等研究发现圣罗勒精油对黄曲霉菌的最小抑菌浓度为0.3 μL/mL，且在此浓度下，将黑曲霉菌、尖孢镰刀菌、链格孢菌和烟曲霉菌等13种真菌接种在马铃薯培养基中，考察精油的抑菌广谱性。结果显示，圣罗勒精油对所有供试菌种均能显著地抑制其生长，除炭黑曲霉、牙枝状枝孢菌、Aspergillus paradoxus和尖孢镰刀菌外，对其他菌种的抑制率达100%。Morcia等研究发现5种天然活性成分松油烯-4-醇、丁香酚、香芹酮、 1,8-桉叶素、麝香草酚对镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属等10种真菌的生长均具有抑制作用，但抑菌效力各有不同。

植物精油及活性成分的安全性评价

在寻找和筛选植物精油及其活性成分进而研发绿色抑真菌剂时，必须基于其有效成分不仅具有较强的抑真菌作用，而且还应具有较高的使用安全性，应避免有毒抑真菌成分对基质造成二次污染，需不断建立和健全植物精油及有效抑真菌成分的毒理学分析和安全性评价，为抑真菌剂的安全使用提供有力保障。毒理学分析的方法主要有：急性经口毒性、急性皮肤刺激、多次皮肤刺激和眼刺激实验等，其中，急性经口毒性实验最为常用。近些年，国内外就植物精油的安全性评价做了大量研究，见表3。Singh等研究发现木橘精油对黄曲霉菌有较强的抑制作用，并以ig的形式对小鼠进行毒性实验，结果显示该精油对小鼠经口急性毒性的半数致死量（LD50）高达23 659.93 mg/kg，根据急性毒性分级标准，属实际无毒级别。张有林等研究发现百里香精油对黑曲霉菌有抗菌活性，且急性毒性实验显示精油对小鼠的最大无作用灌注量为17.5 g/kg，表明在正常使用的剂量范围内，百里香精油不会对人类产生毒性。吴亚妮等研究发现迷迭香精油的2种活性成分马鞭草烯酮和1,8-桉叶油对小鼠急性毒性的LD50分别为8.088 g/kg和7.220 g/kg，LD50 的95%可信限分别为6.983～9.843 g/kg和 5.173～8.124 g/kg，且其均大于5.000 g/kg，属于实际无毒；1,8-桉叶油的质量分数低于3.5%对小鼠的急性皮肤刺激度均为0，属于无刺激；二者质量分数在50%内，对小鼠急性眼刺激实验显示属于无刺激性。

植物精油及活性成分的抑真菌作用机制

对真菌细胞壁和细胞膜的影响

罗曼等研究发现柠檬醛质量浓度为 0.5 mg/L 时，黄曲霉菌液的实验组电解质渗出率为18.8%，对照组为12.3%，提高32.8%，当柠檬醛达2mg/L时，菌液电解质渗出率为40%以上，结果表明柠檬醛能通过损伤黄曲霉菌的质膜，使其失去选择通透性而进入细胞内对其他细胞器产生影响。戴向荣等研究发现肉桂醛在不同浓度和抑制方式下，毒化黄曲霉细胞孢子，其提取液的260和280 nm的吸光度（A260、A280）值都会增大，丙二醛（MDA）值也均上升，表明肉桂醛首先通过破坏黄曲霉菌细胞的质膜，再使胞内大分子空间结构改变、新陈代谢紊乱，从而抑制黄曲霉菌的生长。Manso等通过扫面电镜观察肉桂精油对黄 A D 曲霉菌超微结构的影响。由图1可知，黄曲霉的分生孢子梗呈现线性、饱满管状的规则结构（图1-A），分生孢子梗顶端产生近球形顶囊，表面密集若干小孢子，分生孢子头呈现典型的球状结构（图1-B），单个菌丝体有序生长且清晰可辨，孢子梗顶端有大量规则完整的分生孢子头（图1-C）；而当肉桂精油量为10 μL 时，分生孢子梗表面出现凸起、凹陷、褶皱、萎蔫、变扁平的现象，甚至出现孢子梗相互粘连在一起，形成不规则的团聚状（图1-D），分生孢子头缩小并模糊，结构变形失去完整性（图1-E）；当精油量为30 μL时，菌丝体完全黏合在一起，单个的菌丝体几乎很难辨别出来，分生孢子也被完全抑制（图1-F）。结果表明，肉桂精油能使黄曲霉细胞壁和细胞膜出现异常，进而抑制黄曲霉菌的生长。

对真菌细胞核酸和蛋白质的影响

Luo 等研究发现当柠檬醛质量浓度达到 1.5 mg/L 以上时，对黄曲霉菌造成致死性DNA损伤，不能被细胞内修复系统所修复，使核 DNA 产生不可逆损伤，并通过显微多道分光光度分析系统、显微激光散射技术、超分辨显微图像分析技术和单细胞凝胶电泳分析技术，在完整的细胞、亚细胞和分子水平上揭示了柠檬醛首先是通过改变黄曲霉菌细胞壁、质膜、线粒体膜的选择通透性而损伤细胞，进入细胞后，使菌丝体 DNA、RNA、脂类和蛋白质等生物合成受到抑制，使有关基因不能表达，进而使其失去对代谢的调节控制以及自我复制的正常进行，最后导致细胞死亡。

对真菌细胞能量代谢影响及其他作用

田俊等以细胞膜和线粒体为作用靶标研究了莳萝子精油对黄曲霉菌的抗菌作用机制。研究发现莳萝子精油作用于线粒体后，抑制线粒体脱氢酶活性，显著减少细胞内ATP的合成，使细胞不能正常进行能量代谢，ATP 酶在水解反应中，将线粒体内大量氢离子泵入至线粒体膜的间隙，从而造成线粒体膜电位的异常；精油作用导致线粒体的功能损伤，进而导致线粒体内活性氧（ROS）的累积，ROS 通过氧化细胞内的生物大分子或介导调亡引起黄曲霉菌死亡。罗曼等研究发现柠檬醛处理组黄曲霉菌细胞线粒体出现形态不规则、结构无序、表面粗糙的现象；线粒体氧化还原酶琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氨酶的活性（以NADP+或NAD+为辅酶时）以及线粒体呼吸速率均较对照组明显降低。结果表明柠檬醛一方面通过减少真菌细胞能量的合成和利用，同时还通过降低NADPH合成量而减少还原力，不可逆地抑制核酸、蛋白质、脂类及糖的合成而导致细胞死亡。

对真菌产毒基因表达的影响

真菌毒素的产生与真菌中产毒基因的调控无疑是密不可分的，如AFs的生物合成共涉及到21步酶促反应，参与其合成的绝大多数基因聚集于某特定基因簇中，其中包括黄AFs生物合成途径调节基因（aflatoxin biosynthetic pathway regulatory gene， aflR），该基因为其他参与黄曲霉毒素合成的基因表达所必需，而一旦 aflR 基因被中断，可抑制其他AFs 合成相关基因的表达，进而影响黄曲霉菌的产毒能力。Jermnak 等研究了白桦精油的活性成分丁香酸甲酯对寄生曲霉菌产毒基因的抑制作用。在不同精油浓度条件下培养菌株后，检测了aflR、pksA 和omtA基因的mRNA表达水平。结果显示随着丁香酸甲酯浓度的增大，aflR、pksA和omtA基因转录的抑制率也不断升高。Yaguchi 等研究了植物精油的2种活性成分早熟素II和胡椒酮对禾谷镰刀菌产毒基因的抑制作用，采用RT-PCR 法分析检测了Tri4、Tri5、Tri6、Tri10 产毒基因的 mRNA表达水平。结果显示，与对照组相比，早熟素II加入培养基后，Tri4、Tri5 基因的转录在供试时间内均被显著抑制，Tri6、Tri10 基因的转录在48和96 h也呈现显著抑制；当胡椒酮的体积分数为300或1 000 μL/mL 时，能够显著抑制4种基因的转录。

结论

我国丰富的植物资源为寻找、筛选、提取和研究植物精油及其活性抑菌成分，开发新型、安全绿色的防霉抑菌剂提供了足够的原料基础。植物精油及其活性成分源于天然，不仅能有效抑制真菌生长及真菌毒素合成，而且具有高挥发性、生物降解性良好、基质中低残留、对环境友好的特点，且其LD50 值较高，对其安全使用提供了有力保障，植物精油及其活性成分已被《美国联邦法规》划定为“一般认为安全（GRAS）”的范畴，提倡将其应于食品基质中进行抑菌防腐。我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》也已将中国肉桂油、丁香叶油、罗勒油、山苍子油、生姜油、姜黄油、香叶油、迷迭香油、八角茴香油和肉桂醛、柠檬醛、大茴香醛、香叶醇、香茅醇、橙花醇、丁香酚、百里香酚、香芹酚、薄荷酮等列入允许使用的食品天然香料名单，也就是说在正常使用的剂量范围内，植物精油及其活性成分不会对人类身体健康和生命安全造成威胁。因此，植物精油及其活性成分能够代替化学合成药剂进行抑菌防霉，可作为新型绿色防霉抑菌剂的重要来源之一。近年来，有关植物精油及其活性成分抑制真菌生长及真菌毒素合成，已经越来越成为了国内外学者研究的热点。虽然，目前将植物精油作为抑菌剂应用于食品、药品、农作物中进行抑菌防霉尚处于研究的起步阶段，但随着大多数化学类防腐抑菌剂的应用越来越受到限制，以天然活性抑真菌成分为原料的植物源抑真菌剂产品必定会受到国内外市场的青睐。坚信凭借着坚实的科研基础和良好的生产工艺，以植物精油及活性成分作为原料的天然抑真菌剂必展现出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。

文章原作：

1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所

2.吉林农业大学中药材学院

3.江苏大学药学院

李燕君1, 2，孔维军1，李梦华1, 3，杨世海2*，杨美华1*

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