iMeta | 河南农大吴刘记课题组-构建玉米内源肽全景图谱

玉米内源肽的全景图谱

●  构建了一个涵盖13种玉米不同组织发育期的全景肽组图谱，共计鉴定了6,100个非冗余的内源肽，极大的拓展了已知的植物内源肽数据库；

● 该图谱揭示了多样化的内源肽表达模式，包括组织特异性、组织增强型和混合型表达模式，揭示了多肽组的高度复杂性；

●  全基因组共表达分析显示，多肽组与源蛋白组数据之间相关性极低，表明了内源肽的功能可能受特有的调控机制，不依赖于传统的蛋白表达调控途径；

●  通过整合加权基因共表达网络分析，我们在内源肽模块中识别出与特定发育阶段紧密相关的功能特征，将为理解植物特定发育阶段的分子机制奠定基础。

引  言

内源肽，通常由2到100个氨基酸组成，作为植物生长、发育和胁迫响应的重要调节因子，正受到越来越多的关注。这些小分子生物物质在多种生物过程中发挥重要作用，包括细胞信号传导、成长调控和防御机制。然而，迄今为止，对植物内源肽的研究主要集中在单个小肽，而且通常仅关注其在特定生物过程中的功能。例如，RAPID ALKALINIZATION FACTOR（RAF）家族已被报道在拟南芥中维持花粉管和根的生长过程中细胞壁的完整性。类似地，肽类激素，如Casparian strip integrity factor 1（CIF1）、CIF2和C‐TERMINALLY ENCODED PEPTIDE（CEP）则参与凯氏带的形成和根生长的调控。然而，除了一些明星小肽，目前尚未在全基因组范围内开展对植物内源肽的研究。

对植物内源肽的研究虽然已经取得了重要的进展，但是尚未像RNA和蛋白质等其他分子的研究那样获得广泛重视。目前，大多数植物全基因组范围的研究主要集中转录组和蛋白质组研究。这些研究为揭示基因或者蛋白在各种生物学过程中的作用提供了新的视野，揭示了植物发育或者逆境响应过程中复杂的调控网络。然而，相对于转录组和蛋白质组，多肽组的研究相对滞后，尚未在植物全基因组范围中进行系统的研究。

结果与讨论

本研究利用实验室前期建立的多肽提取和鉴定方法，通过构建玉米三框翻译数据库，分析了13种玉米组织，包括6–7节间茎（IND）、3叶期幼片（JLB3）、8叶期成熟叶（ML8）、5天主根（PR5D）、7天侧根（SR7D）、19天营养分生组织（VM19D）、雄穗（Tas）、未授粉的花丝（SiU）、雌穗花序（FS）、1毫米叶原基（EP）、授粉后8天胚乳（En8DAP）、授粉后20天幼胚（Em20DAP），从而生成了一个较为全面的玉米内源肽图谱（图1A、附图S1A、B和附表S1），共鉴定出6100种非冗余内源肽（附表S2）。其中，大部分（90.95%）内源肽来自于经典阅读框内，9.05%的肽来自经典阅读框外。在营养组织中，SR7D中鉴定到了最多的肽（2717），而在生殖组织中，En8DAP发现的内源肽最多（2899）（图1A）。此外，大约94%（5748）内源肽长度小于23个氨基酸，且96.4%（5881）内源肽的分子量小于2500 Da（附图S2A、B）。

玉米多肽组在生长转变过程中的动态变化

玉米多肽组在不同发育阶段表现出不同的表达模式。根据其表达模式，内源肽可被分为组织特异性、组织增强性和混合型肽（附图S3）。每种组织中，约有21～680种组织特异肽、2～877种组织增强肽和19～1000种混合型肽被鉴定（图1B和附图S1C、D及附表S2）。SR7D中发现的内源肽数量最多，其次是En8DAP。内源肽在营养和生殖阶段表现出多样化的表达模式，表明了玉米多肽组学的高度复杂性和动态特征（图1C）。此外，组织增强和混合型肽在营养与生殖阶段的表达更为动态，而组织特异性肽的表达则相对较为稳定（图1D、E）。

进一步的富集分析显示，来自36个转录因子（TFs）的260种内源肽在不同组织中的富集情况有所不同。来自NAC（no apical meristem, ATAF1/2, cup‐shaped cotyledon）、WRKY和Golden2-like的内源肽在营养组织中，如成熟叶和营养分生组织中富集较多（图1F和S4）。另一方面，来源于basic helix‐loop‐helix （bHLH）、APETALAS（AP2）和Whirly 转录因子的内源肽则在生殖组织中，如受精的胚、萌发的花粉和未授粉的花丝中富集较多。这些肽可能通过与其他蛋白质相互作用，或者直接结合转录因子的特定功能结构域，来调控转录因子的功能，进而调控根系的土壤养分吸收、叶片的光合作用和气孔调节等组织特异性生物过程。

内源肽在玉米染色体上的分布

内源肽在玉米染色体上广泛分布，其中第一条染色体上分布比例最高（24.57%）（附图S2C）。基于内源肽的不同表达模式，发现不同类别的内源肽在染色体上不是均匀分布的。同时，发现较高比例的组织增强（30.57%，727）、混合型（29.74%，423）和组织特异肽（29.04%，668）位于远端区域（图1H）。共计鉴定到49个内源肽富集区域（6 Mb窗口），包含了2403（39.39%）个内源肽，其中大部分位于染色体的端粒附近（图1G）。这些肽可能通过与核糖核蛋白酶复合体—端粒酶相互作用，参与维持端粒长度稳定性，进而防止在细胞分裂过程中端粒DNA的丢失。相邻肽之间的距离被用来评估内源肽在基因组中的覆盖程度。在本研究中，59.17%（1361）、61.01%（1451）和46.76%（665）组织特异性、组织增强性和混合型肽，分别位于相隔500 kb以内（附图S2D、E）。

接着，我们将三类不同表达模式的内源肽位置与其相应的基因进行了比较。有趣的是，89.73%（2064）、90.37%（2149）和90.71%（1290）的组织特异性、组织增强性和混合型肽，均位于距典型翻译起始位点（TSS）2 kb以内（附图S2F–H）。此外，通过分析内源肽来源的转录本核苷酸序列，发现大多数的（97.57%）TSS为non-AUG型，这与先前的肽组学研究结果一致。

图1. 玉米内源肽定量分析、丰度模式以及染色体分布情况

(A) 玉米组织中鉴定出的内源肽数量分布情况。(B) 各米组织中内源肽的表达模式分类。(C) 玉米组织中内源肽丰度的热图展示。(D) 玉米营养生长阶段组织特异性、组织增强型和混合型肽的丰度模式。(E) 玉米生殖生长阶段组织特异性、组织增强型和混合型肽的丰度水平。(F) 来源于转录因子（TF）的内源肽丰度（表达）水平的家族分析。(G) 玉米内源肽在全基因组的分布情况。染色体右侧的绿色圆圈表示内源肽在该基因组位置上富集。(H) 不同表达类型内源肽在染色体两条臂上的分布情况。

多肽组和蛋白质组共表达网络分析

使用WGCNA R包将玉米发育过程中表达相似的内源肽或源蛋白分组为不同的模块（簇）（图2A，B）。在两种共表达网络中，软阈值设置为5，且无标度拓扑拟合度>0.80，平均连通度低于100（附图S5A，B）。通过这种方法，我们将1,467个内源肽分为6个模块，并将1,690个内源肽来源的蛋白划分为10个模块（图2C，附图S6和附表S3，S4）。接着绘制了每个模块的特征基因表达谱，以识别每个模块在玉米中的最高表达组织。结果显示，内源肽在玉米发育过程中表现出不同于其源蛋白的丰度模式（图2C），表明内源肽可能具有与源蛋白不同的生物学功能，如作为信号分子或调节其他蛋白。此外，内源肽可能通过参与蛋白水解切割、磷酸化、泛素化等翻译后修饰的特有调控机制，在发育过程中承担特殊的功能。

内源肽与其源蛋白的交互关系研究

模块内的内源肽和其源蛋白表现出比不同模块间更弱的相互作用，提示模块间的依赖性较低（附图S7A，C）。基于模块特征（ME）与玉米组织表达相关性的聚类分析，结果显示每组数据可以分为两个主要模块（附图S8A，B）。内源肽分析结果中显示绿色、蓝色和棕色的ME与营养组织（ML8，SR7D，PR5D）呈弱正相关（附图S7B）。而青色、红色和黄色模块与生殖组织（En8DAP，EP，FS）呈现弱正相关性。然而，除红色模块外，源蛋白模块的ME与玉米各个组织的相关性均较差（附图S7D）。红色、粉色和黑色模块的源蛋白ME则分别与生殖组织（SiU，GP和Tas）呈现弱正相关。

尽管内源肽模块与玉米组织的相关性较弱，但较源蛋白模块更为一致，因此我们对内源肽的相关模块的功能特征进行了进一步分析。例如，蓝色模块（SR7D）包含了与根毛生长和根向水性相关的内源肽（如root hair defective 3 (RHD3) GTP结合蛋白、roothairless1和plasma membrane‐associated cation‐binding protein 1 (PCAP1)。同样地，绿色模块中的内源肽则主要在成熟叶中高表达，包含了参与光合作用的内源肽；青色模块中则包含来自驱动蛋白家族的肽（如P92：LQESLGGNAKLAM），该肽家族的成员已被报道在玉米胚乳发育中发挥着关键作用。最后，内源肽-蛋白之间相互作用分析可能为揭示内源肽如何在植物发育阶段和生理过程中起到特定调控作用，以及其在玉米发育中的分子功能提供更深入的理解。

全基因组范围内内源肽与蛋白质相关性研究

先前在拟南芥和玉米的研究报道中显示转录组与蛋白质组之间存在弱正相关性。然而，多肽组与蛋白质组之间的相关性尚不明确。本研究中，内源肽与源蛋白的Spearman相关性在-0.06到0.21之间，而内源肽与邻近蛋白的相关性接近于零（图2D和附表S5），表明内源肽的组织特异性调控可能不同于蛋白质的调控机制，或者内源肽在同一生物调控过程中发挥了与蛋白质相反的功能。进一步的主成分分析（PCA）表明，内源肽数据集的主成分与源蛋白和邻近蛋白数据集的主成分明显不同（图S9A–C）。

随后，我们在全基因组范围内评估了内源肽与其相关蛋白的相关性。结果显示95.95%的内源肽-源蛋白对显示出显著的负相关至弱正相关（r > − 0.46 和 r < 0.70，p = 1.694 × 10⁻⁷，two‐sided Wilcoxon signed‐rank test）（图2E）。仅有269个内源肽-源蛋白对的共表达相关性较高（r > 0.70），这些源蛋白主要富集在细胞代谢过程中，包括原始糖酵解途径（图2F）。相比之下，仅有35个内源肽-邻近蛋白对表现出显著较高的相关性（r > 0.70，p = 1.362 × 10⁻⁴³）（图2G）。此外，肽-肽对的表达相关性与距离呈负相关（最高可达200 kb）（图2H）。内源肽与蛋白的显著低相关性以及与其相关蛋白的非保守共表达情况，可能归因于多种因素，如内源肽和蛋白从合成组织向其他部位的转运、可变剪接、稳定性、翻译后修饰，以及细胞内肽与蛋白之间动态的相互作用等。

图2. 内源肽与相关蛋白的WGCNA及全基因组共表达分析

(A) 内源肽共表达的系统树状图及模块划分。(B) 源蛋白共表达的系统树状图及模块划分。(C) 基于加权共表达网络分析（WGCNA）的内源肽（绿色）和源蛋白（红色）的表达模式分析。(D) 不同组织中肽与源蛋白（左）和肽与邻近蛋白（右）之间的Spearman相关性。(E) 相邻肽-肽对和肽-源蛋白对之间Pearson相关系数r的密度分布。(F) 与内源肽高度相关（r > 0.70）的源蛋白的生物过程富集分析。(G) 相邻肽-肽对和肽-邻近蛋白对之间Pearson相关系数r的密度分布。(H) 在不同距离区间内，肽-肽和邻近肽-蛋白对之间的Pearson相关系数 r的分布。

讨  论

本研究首次构建了一个植物（玉米）内源肽的全景图谱，揭示了内源肽在不同发育阶段的动态表达模式和组织特异性分布规律，这将为解析玉米内源肽的调控机制奠定重要的基础。进一步通过比较多肽组与源蛋白质组数据，发现多肽与源蛋白数据之间相关性极低，表明内源肽可能具有与源蛋白不同的生物学功能，暗示了生物体内内源肽存在不同于源蛋白的表达调控机制。该研究将为理解植物内源肽的调控机制提供重要参考，为植物生物学研究提供新的视角，同时，也为未来利用内源肽进行作物改良奠定基础。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、SCIE、ESI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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