图1：研究微生物生理学的传统方法示例。微生物组领域的大多数生理学靶向技术依赖于遗传上可接受的纯培养物的可用性，依赖于不能直接将基因型与表型联系起来的破坏性分析，或者不能在单细胞水平上研究功能活性。a：稳定同位素探测可以与二次离子质谱(SIMS)和荧光原位杂交(FISH)相结合，以联系细胞功能和身份。同位素重DNA可以通过浮力密度离心从轻DNA中分离出来。在定量稳定同位素探测(qSIP)中，通过16S核糖体RNA基因测序或宏基因组学收集和分析多个密度级分。b： 如果可以获得遗传易处理的微生物，可以使用报告基因构建体对它们进行研究，这可以直接洞察细胞之间代谢和合成代谢活动的变化。c： 整个微生物群落或单个细胞的基因组成可以通过宏基因组学或单细胞基因组学来研究。单细胞基因组学通常只捕获微生物群落中最丰富的成员，而宏基因组学将从许多单个细胞获得的基因组信息整合到群体基因组中，即宏基因组组装的基因组。d： 许多生物地球化学方法将微生物组样品视为未定义的“黑箱”,但提供了对整体群落活动的高度灵敏和精确的测量。
图2：研究微生物的下一代生理学工作流程。使用微创方案获得微生物组样品，并使用非破坏性方法检测感兴趣的表型，例如通过光学或荧光显微术或拉曼显微术。无标记方法针对细胞的内在特性，包括趋化行为、辅因子或色素的表达或储存化合物的存在。基于标记的方法将化学报告分子引入细胞，提供有关动态过程的信息。稳定同位素探测(SIP)结合拉曼显微光谱揭示底物同化作用。底物模拟探测(SAP)使用携带荧光标记或侧基的分子来获得关于细胞的整体生物合成活性或特定酶功能的信息，所述侧基服从叠氮-炔点击化学。在鉴定了表达感兴趣的表型的细胞后，使用例如光镊、激光显微解剖或静电偏转从样品中分离出相同的细胞。然后，未经改变的分选细胞将被用于下游应用，这可能包括全基因组测序、定向培养或补充显微分析。
图3：微生物下一代生理学中的报告基因及其相关的拉曼光谱指纹图谱。a：无标记的报道分子由细胞产生，不需要研究者添加。底物模拟探针(蓝色)是可追踪的化合物，可进行生物正交标记，并在添加到微生物组样品后，由感兴趣的细胞掺入生物质中，而不是其天然对应物(红色)。许多底物类似物探针含有叠氮化物或末端炔基，它们可以与荧光染料结合，通过点击化学进行检测。最后，同位素探针(绿色)可以添加到样品中，以跟踪同位素标记化合物的摄取和结合。b：与未标记的细胞相比，将稳定同位素结合到生物质中导致标记细胞的光谱向更低波数的光谱移动，并且这些移动中的一些足够明显，可以通过拉曼显微光谱检测到。该图显示了最常用的指示峰位移的例子，用于跟踪同位素掺入单细胞，从左到右包括苯丙氨酸(13C)的对称环呼吸效应、腺嘌呤的C-H拉伸(15N)和脂质和蛋白质的C-H拉伸(2H)。其他报告分子，包括炔烃标记的底物类似物和一些无标记化合物，例如细胞色素和类胡萝卜素，具有独特的拉曼光谱指纹，也可用于表型检测。
技术方法
介绍了多种先进的技术手段，如单细胞测序、荧光标记技术、微流控技术等，这些技术能够实现对单个微生物细胞的分析，获取其基因表达、代谢状态等信息。
强调了这些技术在分辨率和灵敏度方面的优势，能够揭示微生物群落中细胞间的异质性。
应用领域
在生态系统研究中，通过单细胞水平的分析可以更好地理解微生物在生态过程中的作用，如物质循环、能量转换等。
在医学领域，有助于深入了解微生物与宿主的相互作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
在工业应用方面，可用于优化微生物发酵过程，提高生产效率。
挑战与展望
指出目前研究中面临的挑战，包括技术的复杂性、数据处理的难度以及对不同微生物的适用性等问题。
展望未来，随着技术的不断进步，单细胞水平的微生物组研究将为各个领域带来更多的突破和创新。
该文献详细阐述了新一代生理学方法在单细胞水平研究微生物组功能的重要性、技术手段、应用领域以及面临的挑战和展望。这些方法为深入了解微生物群落的复杂性和多样性提供了有力工具，有望在生态、医学和工业等领域发挥重要作用。
