Article，2022-10-29，npj Biofilms and Microbiomes Journal，[IF 9.2]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41522-024-00586-6

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41522-024-00586-6

第一作者：Yulong Li（李昱龙）；Xianming Cao（曹贤明）

通讯作者：Ben Fan（樊奔）；Dejun Hao（郝德君）

主要单位：

南京林业大学林草学院，中国南方可持续林业协同创新中心

南京农业大学生命科学学院

目前，已知参与细菌磷代谢的调节因子几乎都是蛋白质。在这项研究中，我们鉴定出一种在贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）中的phoPR基因3'UTR中编码的保守新型小调节RNA（sRNA），名为PhoS。在磷缺乏条件下，PhoS的表达受到强烈诱导，并受到转录因子PhoP的刺激。相反，PhoS通过与phoP mRNA的核糖体结合位点结合，促进PhoP翻译。PhoS至少通过增强与基质相关的基因（如eps基因和tapA-sipW-tasA操纵子）的表达，促进芽孢杆菌生物膜的形成。PhoS对PhoP表达的正向调节有助于增强PhoS对生物膜形成的促进作用。在革兰氏阳性芽孢杆菌物种中，调控生物膜形成的sRNA很少被报道。该研究强调了参与两个重要生物学过程（磷代谢和生物膜形成）的sRNA的重要性。

磷（P）是地球上第五大最丰富的元素（仅次于C、H、O、N），对包括微生物在内的所有生物生长至关重要。在自然环境中，微生物经常会遇到无机磷（Pi）限制，这使细菌进化出一种能够感知和响应这种关键的环境信号的动态系统。细菌用于控制磷酸盐（Pho）调节子的调节系统，即革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）中的PhoR-PhoB系统和革兰氏阳性菌（如枯草芽孢杆菌）中的PhoP-PhoR系统，可作为研究双组分系统（TCS）的范例。在这两个系统中，第一个蛋白质是具有完整膜结构域的感应组氨酸激酶，第二个蛋白质是同源反应调节剂和转录因子。了解磷酸盐代谢的调控网络不仅对于微生物在农业中的应用（例如生物防治剂和微生物肥料的开发）具有重要意义，而且对于制药和工业生产也具有重要意义。例如，在发酵罐中，高磷酸盐水平通常会导致所需次级代谢物的产量降低，而降低磷水平通常会导致微生物生长显著下降。当全面了解控制细菌磷酸代谢的调控机制时，这个悖论可能会得到解决。到目前为止，在细菌中，蛋白质已被确定为磷酸代谢的主要调节剂，而关于其他类型的调节剂（如sRNA）参与的报道很少。

生物膜是微生物在两相界面形成的高度结构化的聚集体，是自然界中细菌群落的普遍形式。生物膜中的细菌细胞被包裹在自身产生的细胞外基质中，在模式微生物枯草芽孢杆菌中，该基质含有两种主要物质：胞外多糖（EPS）和纤维蛋白TasA。EPS由eps操纵子的产物合成，而TasA是一种形成纤维支架的蛋白质，由tapA-sipW-tasA操纵子产生和组装。生物膜形成因其临床和工业相关性而得到广泛研究，并且目前对其潜在的调控机制已经获得了深入了解。控制生物膜形成的调节因子大多数是蛋白质，主要存在于革兰氏阴性细菌中，例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。在少数报道中，sRNA也与革兰氏阳性细菌病原体（例如金黄色葡萄球菌）的生物膜有关。然而，关于sRNA如何调控革兰氏阳性益生菌（例如贝莱斯芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）中的生物膜形成的报道很少。

植物促生菌B. velezensis FZB42在系统发育上与枯草芽孢杆菌接近，是革兰氏阳性植物生长促进根际细菌（PGPR）的重要成员之一，对农业具有重要意义。FZB42可以形成坚固的生物膜并产生超过十种抗生素，可抑制多种植物病原体。作为模式PGPR，FZB42在植物-微生物互作方面得到了广泛的研究。在之前的工作中，我们在FZB42中发现了数十个可能参与植物-微生物互作的sRNA候选物。在这项工作中，我们对其中一种名为PhoS的候选物进行了深入研究。我们发现PhoS同时参与磷代谢和生物膜形成。本研究阐明了这些分子作用机制及其相互关联的因素。

PhoS is a 66-nt sRNA encoded in the 3’UTR of phoR

本研究利用植物益生细菌FZB42为材料，发现了一个新的非编码sRNA，命名为PhoS。通过转录分析和3'-RACE检测证明，PhoS存在于phoP-phoR操纵子的3'端非翻译区（3'UTR）。PhoS长度为66个核苷酸，下游存在一个典型的Rho不依赖型终止子。PhoS的表达在细胞进入稳定期时开始增加。基因序列比对表明，PhoS在植物相关Bacillus物种中高度保守，具有潜在重要的生物学功能（图1f）。

图1 sRNA PhoS在B. velezensis FZB42中的表达和特性。

a. 在四种不同培养基（1 CM、+RE、+SE、+RS）中通过Northern blot检测到的PhoS表达谱。在生长曲线上箭头所示的六个不同时间点对细菌培养物进行取样以提取总RNA。

b-c. 通过dRNA-seq测序读取（b）和引物延伸（c）确定PhoS的转录本。c中的泳道1和泳道2是相同的样本负载；箭头指示phoS的转录起始位点（TSS）。

d. UNAfold预测的phoS基因排列（上）和PhoS二级结构（下）。

e. 使用GFP报告构建体分析三种FZB42衍生菌株FB24（amyE::promoterless-gfp）、FB26（amyE::P_phoS(~360bp)-gfp）和FB27（amyE::P_phoS(~180bp)-gfp）中不同长度的phoS启动子区域，通过紫外线（上图，GFP）和白光（下图，Epi）进行可视化。

f. 相关芽孢杆菌种间phoS编码区和侧翼区的序列比对。BAY：B. amyloliquefaciens FZB42；BSU：B. subtilis subsp. subtilis 168；BLD：B. licheniformis DSM13；BPU：B. pumilus SAFR-032；BAE：B. atrophaeus BATR1942_12330；BWE：B. weihenstephanensis BcerKBAB4；BTB：B. thuringiensis BMB171；BCG：B. cereus G9842；BAN：B. anthracis Ames；BCY：B. cytotoxicus NVH 391-98。箭头表示FZB424中phoS的 +1 位点。图中标出了推定的启动子基序和Rho非依赖性终止子序列。

PhoS promotes biofilm formation in Bacillus

通过在B. subtilis菌株中过表达phoS，发现phoS显著促进了生物膜的形成；而在FZB42中敲除phoS，则一定程度上削弱了生物膜的形成作用，尤其是phoS和tasA双突变株完全丧失了生物膜形成能力（图2）。

图2 PhoS促进Bacillus物种的生物膜形成

a. phoS对枯草芽孢杆菌菌落形态的影响。含有空载体（pDG148-stu）、携带phoS的载体（pDG148-stu/phoS+）或无载体的枯草芽孢杆菌168和DK1042在LB琼脂平板（前两排）和MSgg琼脂平板（第三排）上于25 °C下生长一周。

b. phoS缺失对FZB42生物膜形成的影响，其野生型、∆phoS突变体和phoS回补菌株（Compl.）在LBGM培养基和含CR的LBGM中或在含有CR和考马斯亮蓝（BB）的LBGM琼脂上生长。

c–e. phoS缺失对（c , d）B. velezensis FZB42和（e）B. subtilis DK1042生物膜形成的影响。

PhoS enhances expression of genes involved in Bacillus biofilm formation

通过转录组测序和qPCR研究表明，phoS敲除显著降低了生物膜关键基因tapA-sipW-tasA操纵子和eps操纵子的表达（图3a-c）；而在产物水平的检测表明，phoS敲除显著降低了芽孢杆菌胞外多糖的产生（图3d-e）。

图3. PhoS调控Bacillus生物膜形成相关基因表达

a. FZB42野生型与其∆phoS突变体转录组之间的DEGs。

b-c. 通过qPCR验证了（a）中选定的生物膜相关DEGs的转录水平。

d. epsA、tasA和phoS对FZB42菌落形态的影响。

e. phoS对B. subtilis DK1042和B. velezensis FZB42产生EPS的影响。

Expression of phoS is induced by phosphate starvation and requires PhoP

研究发现，PhoS的表达在低磷条件下表达量显著上升，且在一定范围内，其表达水平与环境中Pi浓度反相关（图4a-c）。通过构建GFP报告子和定点突变证实，转录因子PhoP可以直接结合到PhoS的启动子区域，激活其转录（图4d-f）。这与PhoS表达受磷酸盐饥饿诱导的结果相一致，说明PhoS的表达受到芽孢杆菌转录因子PhoP的调控，是PhoP调节子的重要一员。

图4 磷素水平及转录调控因子PhoP对PhoS表达的调控作用。

a. 携带P_phoS-gfp转录融合基因的GFP报告菌株在GP培养基中四种不同的Pi浓度（0.3、3、30和60 mM）下生长。

b. 在六种不同的Pi浓度（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5和1.8 mM）下进行了类似的测定。

c. Northern blot显示在含有两种不同磷酸盐浓度（0.3和1.8 mM）的GP培养基中生长的FZB42中的phoS表达。

d–f. phoP对FZB42中phoS表达的影响。

PhoS promotes expression of PhoP by targeting 5’UTR of phoP mRNA

进一步研究发现，phoP mRNA是PhoS的重要靶标。Northern blot和报告基因测试表明，PhoS靶向phoP mRNA的5'UTR（图5a-b）。生物信息分析表明，phoP mRNA的5'UTR存在抑制翻译的茎环结构（图5c），通过一系列严格的定点突变、互补突变试验表明，PhoS通过与phoP 5'UTR互补结合，释放了被茎环结构占据的核糖体结合位点，从而促进了phoP mRNA的翻译（图5d-h）。

图5. PhoS通过释放phoP mRNA的5'UTR中被封闭的RBS增强PhoP翻译表达

a. qPCR显示phoS过表达对phoP转录的影响。

b. phoS过表达对携带翻译融合phoP::gfp的B. subtilis DK1042中phoP表达的影响。

c-d. 预测的phoP mRNA 5′UTR二级结构，其中茎环结构Ⅱ隔离了RBS。PhoS与5′UTR结合打开了结构Ⅱ并使RBS可供翻译（d）。RBS以绿色表示，起始密码子以红色表示。PhoS的种子区域以灰色阴影表示。星号表示在（g、h）中为检测而突变的核苷酸。

e-f. phoS核苷酸突变对phoP表达的影响，以（e）GFP荧光和（f）α-GFP抗体表征。

g-h. 在不存在（g）和存在（h）phoS的情况下，在有/无补偿性核苷酸替换的情况下，phoP mRNA结构Ⅱ的茎区处核苷酸替换对phoP::gfp翻译融合活性的影响。

PhoS releases the sequestered RBS of phoP mRNA

本研究构建了一套适合在芽孢杆菌中研究sRNA功能的体系，通过实验证明，PhoS基因受到转录因子PhoP的转录激活，而PhoS在转录后水平通过解除phoP mRNA 5'端抑制性的二级结构而促进PhoP翻译，两者构成了一个自我强化的自调控系统，以此快速响应环境中磷素水平的变化。此外，通过PhoP regulon的影响，PhoS能促进芽孢杆菌生物膜的形成。

在本研究中，我们鉴定出了一种3'UTR衍生的sRNA PhoS，其在环境磷酸盐缺乏的情况下可诱导表达，同时调节芽孢杆菌的生物膜形成。PhoS在芽孢杆菌物种复合体中高度保守，该物种复合体包括许多在农业和工业上重要的菌株（如模式微生物枯草芽孢杆菌168）。根据我们的研究结果，我们提出了PhoS调节芽孢杆菌磷稳态和生物膜形成的模型（图6）：

在Pi限制条件下，转录调节因子PhoP增强PhoS的表达，而PhoS反过来又通过阻止其5'UTR处的抑制结构（隔离RBS）来促进phoP mRNA翻译。这两种调节构成一个自我强化的自调节环路。该环路可能导致对Pi稀缺的敏感反应，使芽孢杆菌能够动态适应环境中的Pi水平。同时，PhoS可以通过PhoP调节子影响生物膜的发育。因此，我们得出结论，PhoS可以通过PhoP调控tuaA-H操纵子来促进生物膜形成。

图6. sRNA PhoS调节芽孢杆菌生物膜形成及其在磷酸盐限制条件下的转录示意图。

PhoS的表达需要转录调节因子PhoP，而PhoP的翻译由PhoS促进，形成一个自身调节环。PhoP与srf操纵子和comQXPA操纵子的启动子区结合，激活它们的转录。ComA刺激表面活性素的产生和degQ的表达。ComA通过Spo0A正向调节生物膜的形成。粉色线表示本研究中通过实验证明的调节，而其他颜色的线表示来自文献的调节，推测它们在PhoS调节生物膜形成中发挥作用。虚线表示间接调节。此处所示的基因或操纵子的长度与它们的实际大小不成比例，它们的位置也不完全与它们在FZB42基因组中的相对位置一致。EPS：细胞外聚合物（基质）；CW：细胞壁；CM：细胞膜。

Li, Y., Cao, X., Chai, Y. et al. A phosphate starvation induced small RNA promotes Bacillus biofilm formation. npj Biofilms Microbiomes10, 115 (2024). https://doi.org/10.1038/s41522-024-00586-6