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尽管机械负荷对于保持骨骼健康和对抗骨质疏松至关重要，但其实际应用在很大程度上受到骨骼对机械负荷响应高度变异性的限制。骨理学响应的高度变异性背后的机制仍然未知，寻找适当的措施来提高骨的力学调节效率和质量已成为越来越热点的问题。近年来肠道菌群的多样性引起广泛关注，有研究表明肠道菌群与骨骼稳态之间存在联系。在此发现，肠道微生物的缺失显著降低了骨骼对机械负荷的适应能力。本研究确定了一种有效抗骨质疏松的途径，以最大限度提高了机械负荷。
2024年5月7日，第四军医大学等机构的科学家在Cell Metabolism（IF：29.0）杂志上发表题目为“Gut microbial alterations in arginine metabolism determine bone mechanical adaptation”的文章，采用了单轴胫骨加载和跑台两种模型揭示了肠道菌群作为骨骼机械适应性主要调节者的重要作用，还确定了毛螺菌科细菌在骨骼对负重运动适应性差异中的主导贡献。发现微生物产生的L-瓜氨酸及其转化为L-精氨酸是骨骼机械适应的关键调节因子。机制上，L-精氨酸介导的骨骼对力学负荷的益处主要是由于在成骨细胞中激活了一个复杂的由一氧化氮（NO）-钙（Ca2+）正反馈放大环路所驱动的机制。
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主要内容
1. 微生物耗竭的小鼠中骨骼对机械载荷的反应性受到抑制
作者首先检测了使用抗生素（Abx）消除微生物后，负载介导的骨增益是否受到抑制。用含氨苄西林、甲硝唑、新霉素和万古霉素的抗生素处理小鼠2周，已被证明可有效清楚经典肠道菌群，并易于促进供体肠道菌群的定植。处理结束后，从Abx处理的第2周结束开始，对单侧右侧胫骨施加2周的约束循环压缩载荷（图1A）。微型计算机断层扫描（micro-CT）和HE染色结果显示，对照组小鼠中负载诱导的胫骨皮质骨和骨小梁的质量和厚度显著增加（图1B）。小鼠的机械负载对皮质/骨小梁结构不再有显著影响（图1B-C）。与负载对照的小鼠相比，Abx处理的小鼠中没有检测到负载后骨力学性能的变化（图1D）。同样在对照小鼠中观察到的负载诱导的成骨细胞介导的骨形成增加和破骨细胞介导的骨吸收减少，骨细胞凋亡，以及骨细胞相关的骨硬化蛋白和核因子κB受体活化因子配体的表达在Abx处理的小鼠中得到抑制(图1E-J)。![]()
图1 抑制微生物的小鼠中骨对机械载荷的反应性受到抑制
2. HRs和LRs在跑台运动后肠道菌群组成上表现明显差异
随后对55只小鼠进行了为期6周的跑台运动实验，基于活体显微CT分析，作者比较了跑台训练相对于之前的骨小梁/皮质骨量的变化。共有7只小鼠骨小梁体积分数（BV/TV）比值增加＞40%，皮质骨厚度（Ct.Th）比增加＞30%，被定义为高反应者（HRs），而8只小鼠BV/TV，Ct.Th比值＜5%，被定义为低反应者（LRs）（图2A）。micro-CT统计分析证实，与LR小鼠相比，跑台运动显著改善HR小鼠的一系列骨小梁/皮质结构参数（图2B）。随后作者使用从LR和HR小鼠收集的盲肠内容物样本，基于16S rRNA测序比较之间的微生物组成差异，PCoA主成分分析显示，与LR小鼠相比HR具有明显不同的肠道菌群群落；并且距离分析表明LR和HR小鼠的微生物组成存在明显差异（图2C-D）。作者发现LR和HR小鼠在科水平上细菌的相对丰度存在显著差异，特别是毛螺菌科的丰度（图2E）。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析显示，与LR小鼠相比，HR小鼠的特征是毛螺菌科的丰度显著升高，火山图证实了这一富集（图2F-G）。
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图2 高/低反应者在跑台运动后肠道菌群组成表现出显著差异
3. 来自HRs的肠道菌群移植增强了受体小鼠的骨机械反应性
作者检测了来自LR和HR小鼠的粪菌移植（FMT）对受体小鼠骨机械反应性的影响。所有受体小鼠用Abx处理7天，并移植来自LR或HR供体小鼠的粪便菌群4周，从FMT第2周结束开始施加单轴循环载荷2周（图3A）。RT-qPCR结果显示，与LR受体组相比，厚壁菌门和毛螺菌科在HR受体组的相对丰度显著升高，对照中显著降低，表明FMT可以有效地将供体的肠道菌群转移到受体中（图3B）。与LR受体组相比，HR受体组小鼠的皮质骨/骨小梁骨量、全骨机械强度和成骨细胞介导的骨形成显著增加，而破骨细胞介导的骨吸收显著减少。而PBS中小鼠的皮质和骨小梁骨量、全骨机械强度和骨形成率显著降低，表明破骨细胞数量增加（图3C-I）。![]()
图3 来自HR的肠道菌群移植虽不是来自LR，但增强了受体小鼠的骨机械反应性
作者进一步研究了毛螺菌科家族中的细菌是否增强了受体小鼠的骨机械反应性，这是一个在LR和HR小鼠之间具有明显差异丰度的微生物类群。对分离的23株毛螺菌科进行Sanger测序；小鼠先用Abx处理7天，然后灌胃200 μL毛螺菌科连续四周。从给药第2周末开始施加单轴循环载荷，持续2周。在循环机械载荷作用下，与脑心浸液（BHI）培养基处理的Abx小鼠相比，毛螺菌科处理的Abx小鼠的胫骨皮质和骨小梁结构以及全骨力学性能均发生了显著改善（图4B-D）。此外，灌胃毛螺菌科导致成骨细胞介导的骨形成显著增加，而破骨细胞介导的骨吸收、骨细胞骨硬化素和RANKL的表达以及胫骨中骨细胞的凋亡在循环载荷下显著降低（图4E-I）。![]()
图4 毛螺菌科的应用改善了受体骨骼的机械适应性
5. 微生物产生的L-瓜氨酸及其转化为L-精氨酸的功能是骨机械反应性的关键调节因子
随后作者使用非靶向代谢组分析，寻找LR和HR小鼠盲肠内容物代谢谱的差异。显著性离子特征的总离子流色谱代谢组学云图和代谢物的主成分分析（PCA）表明LR和HR小鼠代谢物聚类模式的明显差异（图5A-B）。在单个代谢物水平上，火山图显示与LR小鼠相比，HR小鼠的盲肠内容物中分别有103和21种代谢物出现上调和下调，火山图和生物合成途径图分析显示，L-瓜氨酸含量在HR小鼠中显著高于LR。（图5C-D）。这种非必需氨基酸可以通过增加血流量和氧气输送来提高人体的有氧和无氧运动能力。在肾脏中，肠道L-瓜氨酸被精氨酸琥珀酸裂解酶转化为L-精氨酸，L-精氨酸进入循环作为一氧化氮合酶（NOS）的底物产生NO，NO是哺乳动物中普遍存在的信号分子，控制着多种生理过程，被认为是介导外界环境刺激转化为细胞内信号事件的第二信使。KEGG通路富集分析发现，氨基酸的生物合成和精氨酸的生物合成过程在HR小鼠中相对于LR发生了显著变化（图5E）。ELISA结果表明，与LR相比HR小鼠血清中L-瓜氨酸和L-精氨酸的浓度显著升高（图5F）。同样高效液相色谱分析显示HR小鼠粪便中L-瓜氨酸水平显著升高（图5G）。随后作者检测了L-瓜氨酸和L-精氨酸对骨机械适应性的影响。首先，对Abx小鼠给予L-瓜氨酸灌胃处理4周，并在L-瓜氨酸处理的第2周末施加2周的限制性循环荷载（图5H）。给予L-瓜氨酸后，小鼠表现为皮质骨/骨小梁骨量和骨机械强度显著增加（图5I-K）。其次，Abx小鼠每天尾静脉注射L-精氨酸4周，从处理第2周末开始施加2周的限制性循环荷载（图5L）。L-精氨酸诱导骨量、机械强度和骨形成率显著增加，破骨细胞介导的骨吸收、骨细胞骨硬化素和RANKL表达以及骨细胞凋亡减少（图5M-O）。基于16S rDNA测序的群落系统发育分析（PICRUSt2）表明，与LR相比，HR小鼠鸟氨酸氨甲酰转移酶（OCTase，催化L-瓜氨酸生成的关键酶）的相对丰度显著增加（图5P）。毛螺菌科中包括梭状芽孢杆菌、共生芽孢杆菌和嗜木糖芽孢杆菌。RT-qPCR结果显示，运动后HR小鼠梭状芽孢杆菌的相对丰度显著高度LR小鼠，而共生芽孢杆菌和嗜木聚糖杆菌无差异（图5Q）。NCBI中获得OCTase基因序列，作者发现梭状芽孢杆菌的基因组中含有OCTase的基因序列（图5R）。梭状芽孢杆菌的3D蛋白结构揭示了一个鸟氨酸和氨甲酰磷酸（CP）的活性位点，OCTase可催化CP与鸟氨酸生成瓜氨酸（图5S）。![]()
图5 微生物产生的L-瓜氨酸及其向L-精氨酸转化的功能是骨机械反应性的关键调节因子
6. L-精氨酸给药改善老年和去卵巢小鼠跑台运动介导的骨量增加
鉴于在老年和绝经后妇女中，骨机械反应性大大降低，并且具有高度异质性。因此作者继续研究继续L-精氨酸是否会增强运动介导的骨增重。首先作者对20月龄老年雄鼠给予L-精氨酸进行为期6周日常跑台运动（图6A）。未L-精氨酸给药老年鼠中基于活体micro-CT分析，检测到训练前后的皮质/骨小梁结构没有显著差异；而给药诱导了老年小鼠在跑台运动后更明显的皮质/骨小梁骨量和骨机械强度的增加（图6B-D）。L-精氨酸处理可以显著增加成骨细胞介导的骨形成，并相应减少破骨细胞介导的骨吸收（图6E-F）。随后对9月龄的去卵巢雌性小鼠进行每天跑台运动和L-精氨酸处理（图6G）。活体micro-CT分析显示，与基线相比，去卵巢小鼠在跑台运动后干骺端骨小梁体积和皮质骨厚度增加约10%（图6H-I）。与未处理的去卵巢小鼠相比，L-精氨酸处理诱导了去卵巢小鼠在跑台运动后皮质/骨小梁骨量和骨机械强度的增加更明显（图6H-J）。在训练中发现L-精氨酸处理的去卵巢小鼠具有明显较高的骨形成率和骨表明成骨细胞数量增多，破骨细胞数量较少的特定（图6K-L）。![]()
图6 L-精氨酸处理改善老年和去卵巢小鼠跑台运动介导的骨量增加
7. L-精氨酸通过触发骨细胞内NO-Ca2+正反馈放大环路增强骨力学适应性
作者进一步研究了L-精氨酸促进骨机械反应性增强的机制。在MLO-Y4骨细胞表面施加2 Pa的层流流体剪切力（FSS），观察到L-精氨酸促进FSS诱导的MLO-Y4细胞胞内的NO、环鸟苷酸（cGMP，NO主要下游信使）、环ADP-核糖浓度的进一步增加（图7A-C）。L-精氨酸处理还增强了FSS介导的细胞凋亡调控以及骨细胞关键相关细胞因子，包括β-catenin、OPG、RANKL和DKK1的基因和蛋白表达（图7D）。基于实时体外细胞内Ca2+成像技术，在MLO-Y4细胞内观察到了Ca2+振荡，并在FSS作用下产生了稳定的重复Ca2+尖峰（图7E）。此外，与正常小鼠相比，老年和去卵巢小鼠均表现为较弱的Ca2+振荡动力学，而L-精氨酸促进小鼠胫骨中骨细胞对机械负荷的Ca2+振荡反应显著增强（图7F-G）。同样，L-精氨酸和L-瓜氨酸对成骨细胞或破骨细胞中FSS引起的Ca2+信号反应均无影响（图7H-I）。这些结果强调了L-精氨酸介导的骨细胞信号激活在微生物代谢产物介导的骨力学适应中的重要性。随后作者使用L-NAME阻断NO的合成，结果发现L-精氨酸诱导的β-catenin和OPG的基因和蛋白表达增加，以及RANKL和DKK1表达的降低在NO被抑制的MLO-Y4细胞中被显著抑制（图7J）。阻断NO抑制了L-精氨酸诱导的MLO-Y4细胞Ca2+振荡动力学的增强以及FSS诱导的cGMP和cADPR浓度的增加（图7K-M）。与NO阻断作用一致，作者证明使用ODQ抑制cGMP可以抑制L-精氨酸介导的FSS诱导的β-catenin和OPG表达的增加以及RANKL和DKK1表达的减少（图7N）。同样，L-精氨酸诱导的FSS诱发细胞内Ca2+振荡增强和cADPR水平升高在ODQ处理后被抑制（图7O-P）。使用拮抗剂9-Br-cADPR抑制cADPR不仅阻断了L-精氨酸诱导的细胞内Ca2+振荡的增强，也部分降低了L-精氨酸诱导的NO浓度增加（图7Q-R）。同样使用丹曲林阻断RyR可以减弱L-精氨酸介导的Ca2+振荡动力学的增强和FSS刺激引起的NO浓度的增加（图7S-T）。这些结果表明，L-精氨酸增强骨机械反应性的机制主要与骨细胞中NO-Ca2+正反馈放大环路的激活有关。![]()
图7 L-精氨酸通过激活骨细胞中的NO-Ca2+正反馈放大环路增强骨机械适应性
研究总结
总之，该研究不仅强调了肠道菌群及其相关代谢产物在调节骨骼对负重运动异质性适应中的重要性，而且更重要的是，为优化由负重诱导的骨骼增强提供了较有前景的干预策略，促进了骨质疏松症的预防和治疗。
仅用于文献解读和分享，不作为商业使用。版权归文章原作者所有，若有侵权请联系删除2024年度国自然医学部50大科研热点的中标数统计如下：
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