高分文章分享 | 带你从分子学角度探究吸烟引发结直肠癌的机制

今天给大家分享的这篇文章发表于Gut期刊上的题为“Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites”的文章，是香港中文大学于君教授团队发现，吸烟还会增加结直肠癌的发生。

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道中常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。香烟烟雾会导致肠道菌群失调，进而改变肠道代谢物且损害肠道的屏障功能，可能会激活结肠上皮细胞的致癌MAPK/ERK信号传导，诱发结直肠癌的发生。

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1. 结直肠癌是全球最常见的癌症之一，有报道表明，在人类戒烟后观察到细菌多样性增加。也有报道表明，微生物群和黏蛋白结构的改变与吸烟有关。然而，吸烟促进结直肠癌发生和发展的机制尚不清楚。

2. 在肠道微生物受到烟雾影响后，其代谢产物含量会产生变化，如，牛磺去氧胆酸（TDCA）等，TDCA是一种已知的致癌原。有报道表明，肠道菌群与代谢类疾病紧密关联，但在结直肠癌方面，肠道微生物、代谢物和病症的潜在关联尚未明了。

本研究探讨吸烟是如何通过影响肠道菌群从而引发结直肠癌的发生。

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1. 首先，作者发现吸烟人群结直肠癌患病率高。

2. 然后，作者观察到小鼠粪便中有害菌群和益生菌群含量有所差异。

3. 接着，作者发现有害菌群会产生代谢物，代谢物进一步影响致癌和促炎信号通路。

4. 最后，作者通过饲粪法菌群移植无菌小鼠，重复验证上述流程以确认吸烟影响下的肠道菌群对小鼠的影响。

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1. 香烟烟雾促进小鼠结直肠肿瘤的发生

探究香烟烟雾对结直肠肿瘤发生的影响，将小鼠分为实验组和对照组，经过氧化偶氮甲烷（AOM）处理的小鼠一组通入新鲜空气作为对照，一组掺入香烟烟雾，AOM是一种创建动物癌症模型的试剂，可有效诱导小鼠结直肠癌。这样28天后处死小鼠，观察结肠肿瘤并统计发病率，结合染色结果观察到烟雾环境中的小鼠的结肠肿瘤数量和大小均显著大于无烟对照组（图1A-C），且烟雾环境中小鼠结肠肿瘤的发病率显著增加（图1D）。

在基础观察的基础上，运用Ki-67免疫组化染色和Western blot两个实验用于观测结肠上皮细胞的增殖情况。可以看出，与无烟小鼠对比，吸烟小鼠Ki-67免疫组化染色的阳性细胞数较高，PCNA含量较高，表明结肠上皮细胞增殖增加（图1E, F）。香烟烟雾起到了促进结直肠肿瘤发生的作用。

2. 香烟烟雾改变小鼠肠道微生物群的组成和相互作用 

首先排除笼子效应对肠道菌群组成的影响后，宏基因组测序分析小鼠粪便，两组小鼠微生物菌群显著不同（图2A, B），有20种肠道微生物的数量发生变化（图2C）。较无烟小鼠，吸烟小鼠肠道微生物中，迟缓埃格特菌（E. lenta）和头葡萄球菌（Staphylococcus capitis）等有害菌数量增加，而肠道有益菌包括罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）等数量减少，尤其是迟缓埃格特菌（图2D）。

对不同处理组的不同丰度细菌间相互作用的生态网络图进行分析，发现富集的迟缓埃格特菌与下降的肠道有益菌之间存在拮抗关系（图2E）。也就是说吸烟增加了有害菌群的数目，并与有益菌形成拮抗作用，导致肠道菌群生态网络被破坏。

3. 香烟烟雾改变粪便中肠道微生物相关代谢物

对粪便代谢组学进行分析发现，有41种代谢物发生了改变。差异代谢物富集主要是胆汁酸生物合成途径，迟缓埃格特菌具有解原胆汁酸的能力，表达胆汁酸外聚酶3β-羟基类固醇脱氢酶。在肠道内，细菌将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，部分被回肠末端和结肠吸收。在这些次级胆汁酸中，TDCA是已知的致癌物质（图3A-C）。

吸烟组小鼠粪便中的TDCA含量要显著高于无烟小鼠，微生物和代谢物的相关性分析显示，迟缓埃格特菌和TDCA之间呈正相关，两种有益菌则和TDCA呈负相关（图3D-F）。也就是说，TDCA含量越高，迟缓埃格特菌含量越高，有益菌含量越低。总的来说，肠道微生物生态失调后，代谢物的改变可能共同促进了结直肠肿瘤的发生。

4. 香烟烟雾损害肠道屏障功能

Western blot与免疫荧光染色结果显示，香烟烟雾显著降低了吸烟小鼠claudin-3和ZO-1水平（图4A, B）。claudin-3和ZO-1作为紧密连接蛋白，含量降低表示肠道屏障功能受损。同时，本研究还发现与无烟小鼠相比，吸烟小鼠的LPS水平显著增加（图4D），LPS是血清脂多糖，是细菌产生的一种毒性因子，可引发炎症。可以看出吸烟小鼠结肠上皮存在大面积空洞（图4C），这些都说明了香烟烟雾会导致肠道屏障功能受损。

5. 香烟烟雾增强结肠上皮致癌的MAPK/ERK信号传导和促炎信号基因的表达

为了解香烟促肿瘤作用的分子机制，本研究分析了结肠上皮癌症相关基因的表达。先前的研究报道表明，TDCA可以激活MAPK通路的ERK亚家族，因此我们评估了吸烟小鼠结肠上皮中MAPK/ERK的激活情况，并与对照小鼠进行了比较。研究发现，与无烟对照小鼠相比，在吸烟小鼠中观察到19个上调基因和7个下调基因（图5A）。富集分析表明，丝裂原活化蛋白激酶（即MAPK）信号通路是香烟烟雾激活的最大通路（图5B）。此外，磷酸化ERK1/2是MAPK/ERK途径中的关键介质蛋白，本研究通过western blot发现吸烟小鼠中磷酸化ERK1/2水平升高，并检测到ERK磷酸化水平与TDCA水平之间存在正相关（图5C）。这些研究表明，香烟烟雾诱导ERK1/2磷酸化并激活MAPK/ERK信号通路，进而促进结肠肿瘤发生。

肠道细菌生态失调与炎症密切相关，炎症与致癌因素和肿瘤发生有关。因此，本研究还对促炎基因的表达进行分析。结果显示，与无烟对照小鼠相比，香烟暴露小鼠中观察到27个上调基因和5个下调基因（图5D）。香烟烟雾诱导包括促炎白细胞介素17（IL-17）和肿瘤坏死因子（TNF）信号传导途径在内的途径改变（图5E）。且定量结果显示，与无烟对照小鼠相比，吸烟小鼠中促炎IL-17a、Cxcl2的表达增加和抗炎IL-10的表达降低（图5F）。此外，研究还发现IL-17a的相对mRNA表达与结肠中迟缓埃格特菌的丰度呈正相关。

这些发现表明，香烟烟雾会促进致癌的MAPK/ERK信号传导和促炎信号基因的表达 。

6. 粪便微生物群移植改变无菌小鼠肠道微生物群

为了证实香烟烟雾改变肠道微生物群对结直肠肿瘤发生的直接作用，我们在无菌小鼠中进行了粪便微生物群移植，研究发现，与无烟小鼠粪便管饲的无菌小鼠（GF-AOM）相比，用吸烟小鼠粪便管饲的无菌小鼠（GF-AOMS）的菌群多样性显著降低且二者微生物群显著分离（图6B, C）。与GF-AOM小鼠相比，在吸烟AOM小鼠中丰度增长的细菌在GF-AOMS小鼠中也持续增加，而在吸烟AOM小鼠中丰度降低的细菌在，GF-AOMS小鼠中持续减少，且GF-AOMS小鼠的迟缓埃格特菌丰度显著高于GF-AOM组（图6F）。这与前期实验的结果相一致。

相关性分析显示，与供体小鼠相比，粪便移植后无菌小鼠的生态网络模块较为保守（图6G）。此外，与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS的粪便TDCA水平也显著增加（图6H）。综上，粪便微生物群移植在无菌小鼠上重现了烟雾对肠道微生物群的改变。

7. 香烟烟雾改变的微生物群诱导肿瘤发生并损害肠道屏障功能

同样对对照组和实验组进行Ki67免疫组化染色和Western blot，与GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠Ki-67阳性细胞数目较多，PCNA含量较高，紧密连接蛋白含量较低，结肠上皮细胞增殖增强（图A-C）。

观察到与GF-AOMS小鼠相比GF-AOM小鼠LPS水平升高（图7D），连接复合物的细胞间连接和结肠的细胞旁间隙变宽（图7E），肠道屏障功能受到损害，这些都与供体的实验结果相一致。LPS的含量上升，claudin-3和ZO-1结肠紧密连接蛋白减少，所以香烟烟雾改变的微生物群损害了肠道的屏障功能。

8. 香烟烟雾改变的微生物群增强致癌和促炎信号传导

供体和无菌小鼠模型的一致发现表明，香烟烟雾改变的微生物群可以直接改变新个体的肠道微生物群体生态，提高TDCA含量影响ERK 1/2磷酸化，激活增强MAPK/ERK信号通路，还诱导了促炎IL-17和TNF信号，这些促进了结直肠肿瘤的发生（图8）。

香烟烟雾在结直肠癌发生的促进作用依赖于肠道微生物群的改变。

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小鼠在烟雾环境下的机制变化如图9。首先受到烟雾影响的小鼠肠道菌群生态改变，有害菌含量上升，益生菌含量降低。其中的有害菌迟缓埃格特菌通过影响胆汁酸代谢途径提高TDCA含量，从而影响ERK 1/2磷酸化，激活增强MAPK/ERK信号通路，使得结肠上皮细胞丧失正常的增殖状态，从而引发结肠肿瘤。另一方面，香烟烟雾减少了claudin-3和ZO-1这两种结肠紧密连接蛋白，增加了结肠上皮细胞的通透性，使得有害物质更容易侵入。香烟烟雾还诱导了IL-17和TNF信号通路，抗炎IL-10的表达量受到抑制。此外，LPS的含量也随之上升。并在无菌小鼠中进行菌群移植重复验证结果，得到相统一的结论。

这些发现表明，香烟烟雾引起的肠道菌群失调在结直肠癌中具有促肿瘤作用。