研究背景
乳酸作为糖酵解的终产物，一直是生物学和运动生理学争论的热点。乳酸最早由瑞典药剂师和化学家卡尔·威廉·舍勒于1780年在酸牛乳中发现。200多年来，乳酸被认为是一种代谢废物，导致疲劳和肌肉酸痛。骨骼肌和其他组织/细胞在完全有氧条件下可以产生乳酸，这一发现促使George Brooks提出了“乳酸穿梭”理论，即认为乳酸是一种能量中间体，在具有高糖酵解活性的细胞/组织中形成，然后被具有高氧化活性的细胞/组织消耗。现在乳酸被认为是细胞/组织中氧化磷酸化的重要能量来源，如氧化肌纤维，也是糖异生的前体。
乳酸的细胞-细胞和细胞内通讯可以通过膜转运蛋白来完成。乳酸的跨膜运动是由溶质载体家族16（SLC16）进行参与完成。这个家族中，单羧酸转运子（MCTs）1-4负责乳酸、丙酮酸和酮体的转运。近年来，人突变相关研究和乳酸转运蛋白相关基因敲除小鼠模型有助于以组织特异性的方式阐明乳酸转运的生理和病理功能，进而表明MCT1在许多生理过程和疾病中的重要作用。但对于MCT1如何影响肌肉功能未见报道。
研究结果
1. 骨骼肌中Slc16a1的缺失增加小鼠代谢速率并改善糖耐量
基于以上背景介绍，作者首先探究了骨骼肌在体内代谢葡萄糖和乳酸的能力。首先图1A通过对小鼠静脉注射U-13C-葡萄糖或U-13C-乳酸，并测定它们在糖酵解和TCA中间代谢物的贡献。静脉注射2.5h后收集血清和骨骼肌测定其贡献值，结果如图1B所示，发现在收集的肌肉群股四头肌（QUA）、腓肠肌（GAS）、胫骨前肌（TA）和比目鱼肌（SOL），与13C-葡萄糖相比，13C-乳酸骨骼肌中含有更多13C标记的糖酵解产物和TCA代谢产物（丙酮酸Pyr、琥珀酸Suc、苹果酸Mal）（图1B）。另外图1C通过13C标记矩阵解卷积研究了这两种循环营养物质对肌内乳酸和苹果酸的直接贡献。随后对肌肉群中乳酸和苹果酸的直接来源是来自循环的葡萄糖还是乳酸进行了接下来的实验，1D图结果表明，循环乳酸在QUA、TA、GAS中贡献了约50%肌内乳酸，在SOL中贡献了约40%肌内乳酸；另一方面，循环葡萄糖对QUA、TA、GAS肌内乳酸贡献小于5%，对SOL的贡献约20%；并且由于肌肉内苹果酸是TCA的代表性代谢物，在所有肌群中仅来源于循环乳酸。这些结果表明，乳酸是骨骼肌TCA循环的首选燃料。前面背景部分介绍得知乳酸是通过单羧酸转运体MCT从循环转运到骨骼肌中，在哺乳动物的16种MCTs中，MCT1、MCT2和MCT4参与了骨骼肌中乳酸的转运。上述结果得知乳酸是骨骼肌TCA循环的首选燃料，随后进一步探究MCT1对小鼠机体代谢的影响。首先通过免疫荧光染色MCT1与不同类型肌纤维的荧光图来标记MCT1主要在哪些类型肌纤维中表达，1E图结果显示MCT1在IIA型和IIX型肌纤维的细胞膜上表达。随后（1F图）使用骨骼肌特异性敲除（mKO）小鼠模型对MCT1进行重点探究，1G图通过RT-qPCR验证造模成功。此外（1H,I图）在正常饮食情况下，KO组小鼠的体重和瘦体重（去脂体重）出现降低，（1J图）并且KO小鼠的GAS QUA SOL三种肌肉的重量均出现下降。K图中代谢笼分析显示，KO小鼠的CO2生成量、耗氧量、白天呼吸交换率（RER）和夜间静息能量消耗（REE）均增加。并且KO小鼠的糖耐量有所改善（图1L）。总之，这些数据表明骨骼肌中敲除MCT1降低了小鼠的体重、提高代谢率，改善糖耐量。
图1 骨骼肌Slc16a1缺失小鼠的代谢表型
2. 骨骼肌敲除MCT1提高了肌内乳酸水平，改善运动耐力，并使肌纤维向氧化型转变
随后为了探究骨骼肌中特异性敲除MCT1对肌内乳酸和运动能力的影响，进行了接下来的实验。由于MCT1是乳酸的主要转运体，随后作者测定了骨骼肌中的乳酸变化水平，2A图结果表明在比目鱼肌和股四头肌中，KO小鼠的乳酸水平均高于WT组；此外探究了小鼠的运动能力，2BCD图结果显示KO小鼠在跑台实验后表现出较低的乳酸水平，但表现出更好的耐力，主要测试快速糖酵解肌肉力量的最大抓力也出现降低。接下来利用免疫荧光对不同类型的肌纤维进行鉴定，2E图结果显示KO小鼠在SOL、GAS和TA中，快收缩氧化型IIA纤维比例显著增加，快收缩糖酵解型II B纤维比例显著减少。以上数据表明，骨骼肌中敲除MCT1提高局部乳酸水平，增强跑步耐力，促进了肌纤维从糖酵解型向氧化型的转变。为了探究敲除MCT1对骨骼肌代谢流的影响，图1中通过静脉注射13C-葡萄糖和13C-乳酸来测定了它们对骨骼肌糖酵解和TCA循环的贡献，总体而言，骨骼肌Slc16a1缺失影响乳酸水平改善跑步性能，促进氧化肌纤维的形成。
图2 骨骼肌Slc16a1缺失影响乳酸水平改善跑步性能，促进氧化肌纤维的形成
3. 敲除MCT1增加了骨骼肌中葡萄糖的糖酵解通量和TCA通量
在3A和D图中敲除MCT1提高了葡萄糖对糖酵解和TCA的贡献，而乳酸的贡献减少。并且在3BC图中，KO小鼠肌肉群中，血糖对肌肉内乳酸和苹果酸的标准化直接贡献出现升高。因此相反，3EF图中血乳酸对肌肉内乳酸和苹果酸的标准化直接贡献出现降低。因为不同肌纤维之间存在代谢的多样性，3G图显示作者随后通过灌胃13C-葡萄糖来直接检测骨骼肌中的糖酵解和TCA通量；2H热图标记小鼠SOI肌肉中糖酵解和TCA循环主要代谢物的13C标记离子总数，表明在氧化型肌肉SOL中，糖酵解和TCA中间体的13C标记离子数在灌胃后15和30min时大多数增加，在60min出现下降。随后对SOI肌肉TCA循环中13C标记代谢物总离子计数进行测定，结果如图3i、j、k、l和m所示，TCA中间产物包括柠檬酸、谷氨酸、延胡索酸、苹果酸和天冬氨酸显著增加，而3n图中琥珀酸在30min有增加趋势，60min时降低。总的来说，这些数据表明，在骨骼肌中敲除MCT1导致糖酵解通量和从葡萄糖产生的TCA通量显著增加。
图3 骨骼肌Slc16a1缺失促进小鼠的糖酵解和TCA通量
4. 抑制MCT1增强C2C12肌管细胞中的糖酵解和TCA通量
为了更好地了解MCT1对糖酵解和TCA代谢的影响，作者在体外用MCT1的高效抑制剂AZD3965阻断MCT1。随后用13C-葡萄糖处理分化的C2C12细胞，并检测糖酵解和TCA中间体，结果如图4A所示，发现AZD3965显著提高细胞内乳酸水平，同时降低了细胞外乳酸水平。作者首先分析了阻断MCT1对葡萄糖流向糖酵解和TCA循环通量的影响（4B图）。结果显示使用AZD抑制剂后，C2C12细胞的糖酵解中间体和产物，包括葡萄糖-6-磷酸（G6P）、3-磷酸甘油酸（3PG）、丙酮酸和乳酸均显著增加（图4C-F）。随后通过比较细胞中M+2和M+3 TCA中间产物的水平，检测了丙酮酸脱氢酶PDH和丙酮酸羧化酶PC的活性（图4G-Q）。在AZD抑制剂处理后，M+2和M+3 TCA中间体均升高。这些数据表明，阻断MCT1促进了C2C12肌管中葡萄糖的糖酵解和TCA通量。
图4 AZD3965抑制C2C12肌管中MCT1可增强糖酵解和TCA通量
5. 骨骼肌中敲除MCT1促进线粒体的生物发生和功能
由上述的研究结果我们得知，敲除MCT1会导致IIA型肌纤维增加，而IIB型肌纤维减少，因此作者推测MCT1可能会影响骨骼肌线粒体功能。IIA和IIB纤维都属于快肌纤维，IIA比IIB具有更强的氧化能力，线粒体丰度可区别两种纤维的不同。作者首先对WT和mKO小鼠的GAS肌肉进行RNA测序，分析基因表达谱的变化。对差异基因进行基因本体GO分析，结果如图5A所示发现KO小鼠中与线粒体功能相关的基因富集，如电子传递活性、NADH脱氢酶活性和线粒体组织。5B图中在KO小鼠肌肉中与线粒体呼吸复合物相关的一组基因也出现升高。通过WB验证上述结果准确性，5C图显示在KO组中，线粒体复合物亚基（NDUFB8、SDHA、UQCRC2和MTCO1）的蛋白水平出现上调。并且5DE图透射电镜TEM分析显示KO小鼠的骨骼肌中线粒体数量显著增加，横截面积减小，但直径没有变化。此外5F图中KO小鼠GAS肌肉中分离的线粒体表现出更高的耗氧率和呼吸控制率。通过四唑蓝染色检测骨骼肌中NADH脱氢酶活性，5G图显示在KO小鼠中出现升高，进一步证明该组小鼠骨骼肌中线粒体活性的增加。已知在慢肌纤维周围毛细血管数量高于快肌纤维，通过CD31免疫荧光发现，5H图中KO小鼠骨骼肌中毛细血管密度增加；并且5I图中KO小鼠骨骼肌中CD31蛋白水平以及与血管重塑相关的转录因子低氧诱导因子1α（HIF-1α）表达出现上调。总之，这些数据表明，肌肉特异性敲除MCT1可增强骨骼肌线粒体生物合成、线粒体活性和毛细血管密度。
图5 骨骼肌Slc16a1缺失增强了线粒体生物合成
6. 在C2C12细胞中敲除MCT1可改变肌管形态、改善线粒体功能
为深入了解敲除MCT1肌肉中线粒体功能的变化，作者接下来探究了用AZD3965抑制MCT1对C2C12细胞成肌分化的影响。免疫荧光染色6A图发现AZD促进肌管形成，表现为6B图融合指数增加，肌管长度增加，肌管直径减小，以及6C图中MyoD（肌管分化标志物）mRNA水平表达增加，I型氧化纤维的标志物表达升高。此外，6D图中AZD提高了I型和IIA型纤维的标志物蛋白水平，降低了IIB型纤维的标志物水平。6EF图表明C2C12肌管细胞中，AZD处理提高了线粒体呼吸复合物亚基基因和蛋白的表达。同样，6G图中在细胞中基于RNA-seq的基因集富集分析（GSEA）结果显示，线粒体组织相关基因与AZD抑制剂的处理呈正相关。此外，6H图OCR分析显示，敲除MCT1提高了C2C12肌管的基础呼吸、最大呼吸和ATP生成（6I图），表明线粒体活性明显增加。总之，这些数据表明在C2C12肌管中抑制MCT1显著影响肌管形态，促进肌纤维向氧化型转变，增强线粒体的生物发生和功能。
图6 C2C12细胞中抑制MCT1可改善线粒体功能
7. 在骨骼肌/C2C12细胞中敲除MCT1，PGC-1α的蛋白水平升高
作为线粒体功能的关键上游调控因子，PGC-1α在骨骼肌中的功能已被证明，并且之前研究表明在骨骼肌中表达PGC-1α，可增加氧化型肌纤维的线粒体含量和氧化酶活性。线粒体生物合成的主要调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）在2B纤维中含量较低。通过对静止或跑步状态下的小鼠或AZD处理的细胞进行免疫印迹发现，图7ABC显示KO小鼠GAS中PGC-1α的蛋白表达均显著升高，以及在AZD处理后C2C12细胞中PGC-1α表达也上调。但肌肉和成肌细胞中PGC-1α的mRNA水平没有明显变化，表明抑制MCT1主要影响PGC-1α的蛋白水平，而不是转录水平。随后考察PGC-1α蛋白的降解速率，使用环己酰亚胺CHX处理C2C12细胞，抑制蛋白合成。结果如图7EF所示，当使用AZS3965处理后，内源性和外源性PGC-1α蛋白的降解速率均出现降低；并且AZD处理使内源性PGC-1α蛋白的半衰期由10.6h延长至19.6h，使外源性PGC-1α蛋白的半衰期从0.4h延长到0.5h。因此这些数据表明，抑制MCT1可以通过减少蛋白降解来增加PGC-1α蛋白水平。上述结果我们得知，MCT1是PGC-1α蛋白活性的关键调节因子，先前研究报道NAD依赖的蛋白去乙酰化酶sirt1是调节PGC-1α蛋白活性的关键分子。因此作者对于MCT1是否能通过sirt1调节PGC-1α蛋白活性进行探究。基于上述GAS肌肉的RNA-seq GSEA结果G图表明，抑制MCT1与NADH脱氢酶复合物相关基因呈正相关。对C2C12细胞进行代谢组学分析7H图结果表明，AZD处理的细胞中NAD+水平和NAD+/NADH比值显著增加。NAD+是sirt1的底物激活剂，7I图显示在C2C12细胞中AZD处理显著提高了sirt1的酶活性，7J图显示降低了PGC-1α的乙酰化水平。总之，这些数据表明，抑制MCT1通过NAD+/sirt1信号通路保护PGC-1α蛋白不被降解，同时增加PGC-1α的活性，从而促进线粒体生物发生和肌纤维向氧化型转化。
图7 骨骼肌和C2C12肌管中抑制MCT1引起PGC-1α蛋白表达升高
研究结论
不同的肌纤维具有不同的乳酸转运蛋白，MTC4表达于糖酵解型肌纤维，MCT1表达于氧化型肌纤维的质膜和线粒体。在糖酵解型肌纤维和氧化型肌纤维之间的细胞-细胞乳酸穿梭由MCT4和MCT1介导，而在氧化型肌纤维中的细胞质-线粒体乳酸穿梭由MCT1介导。乳酸通过氧化型肌纤维中的MCT1和mLOC是线粒体中TCA循环的重要燃料来源。在线粒体中，乳酸被mLDH氧化为丙酮酸。细胞内的乳酸穿梭对于调节细胞中NAD+/NADH的比例非常重要。当MCT1缺失，乳酸不能穿梭到线粒体，丙酮酸转化为乳酸会导致NAD+的净增加。细胞内乳酸穿梭与线粒体生物合成的代偿反应有关。当乳酸的细胞质-线粒体穿梭受阻时，来自乳酸途径的燃料供应不足。细胞感知到燃料不足时，会启动线粒体生物发生来进行补偿，其机制之一是NAD+的增加导致Sirt1和PGC-1α通路的激活，此外骨骼肌中的乳酸穿梭通过调节线粒体生物合成与运动表现相关。
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