三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中复发和死亡率最高的亚型，其中肺是最常见的转移部位。肺部微环境在扩散性肿瘤细胞的定植中发挥关键作用。本研究强调了外泌体TGF-β1的主要形式外泌体LAP- TGF-β1在重塑肺血管微环境，促进TNBC肺转移的关键作用。尽管目前已开发了各种策略来阻断TGF-β信号，并在临床上也取得了进展，但其副作用限制了其治疗应用。本研究中在肺转移部位，外泌体中的LAP- TGF-β1可在低剂量下重塑肺血管微环境，促进TNBC细胞在肺中的外渗和定植。机制上，在乙酰转移酶TIP60作用下，LAP- TGF-β1的KFERQ样序列在K304位点发生乙酰化，促进其与HSP90A相互作用并转运到外泌体中。同时抑制HSP90A和TIP60显著降低LAP- TGF-β1的外泌体负担，为TNBC的治疗提供新途径。
2024年4月25日，中国药科大学中药学院天然产物研究重点实验室等机构的科学家在Molecular Cancer（IF：37.3）杂志上发表题目为“The incorporation of acetylated LAP-TGF-β1 proteins into exosomes promotes TNBC cell dissemination in lung micro-metastasis”的文章，通过基因编辑、原位移植瘤和RNA测序等技术发现了外泌体中的LAP- TGF-β1可在低剂量下重塑肺血管微环境，促进TNBC细胞在肺中的外渗和定植。机制上LAP- TGF-β1的KFERQ样序列在K304位点发生乙酰化，促进其与HSP90A相互作用并转运到外泌体中，为三阴性乳腺癌提供新治疗策略。
研究内容
1. TNBC肺转移部位的外泌体重塑了肺血管微环境
为了了解TNBC肺转移部位外泌体对肺微环境的影响，将MDA-MB-231亲本细胞或BT-549亲本细胞静脉注射到NCG-HLA-A2.1小鼠体内。分离肺转移部位建立的乳腺癌亚群，命名为231 LuT和549 LuT细胞。为了鉴定这些乳腺癌来源的外泌体的特异性器官趋向性，将PKH67标记的231亲本细胞和231 LuT3细胞来源的外泌体注射到NCG-HLA-A2.1小鼠体内，然后通过流式细胞术和荧光分析评估生物分布和摄取情况（图1A）。PKH67标记的231 LuT3外泌体与肺CD31+内皮细胞和S100A4+成纤维细胞显著共定位，分别约占外泌体阳性细胞的40%和30%。（图1B）。免疫荧光进一步证明较大的肺内皮细胞亚群内化了231 LuT3来源的外泌体（图1C）。总的来说，这些发现表明TNBC肺转移外泌体可能通过构建肺血管微环境来增强TNBC肺微转移扩散。
转移性肿瘤的进展主要包括局部组织侵犯、血管内浸润、循环然后外渗到远处组织或器官。为了探究肺转移外泌体对肺血管微环境的影响，作者从免疫缺陷小鼠中分离肺内皮细胞（LuECs），随后将LuECs与PKH67标记的来自231亲本细胞或231 LuT3的外泌体共孵育，免疫荧光发现在不同孵育时间内外泌体对LuECs的摄取不同（图1D）。紧密连接（TJs）在维持血管完整性和决定内皮单层通透性方面发挥关键作用。TJ的主要成分ZO-1在内皮细胞和上皮细胞中组成了大量细胞-细胞黏附复合物，并与乳腺癌转移相关。与PBS和231亲本细胞来源外泌体相比，231 LuT3外泌体抑制ZO-1蛋白表达，损害肺血管内皮的完整性（图1E）。表现为罗丹明标记葡聚糖探针从底部向基部孔外渗，加剧了大分子葡聚糖的渗透性（图1F）。为确定是否通过肺转移外泌体预处理诱导血管重塑，LuECs暴露于231亲本、231 LuT3或PBS来源外泌体，显微成像显示，与PBS或231亲本外泌体相比，231 LuT3外泌体增加了LuECs中的结节和管状结构（图1G）。为进一步阐明 肺转移灶来源的外泌体在调节肺血管微环境中的作用，作者将231 LuT3或231亲本来源外泌体或PBS导入NCG-HL-A2.1小鼠，通过荧光分析评估小鼠肺部情况，与PBS或231亲本外泌体相比，231 LuT3外泌体显著抑制肺CD31+ECs中ZO-1的蛋白表达，损害肺血管的完整性（图2H），同时葡聚糖通透性实验显示231 LuT3外泌体显著增强血管通透性（图1I）。
图1 肺转移性TNBC来源的外泌体修饰肺血管微环境
2. TNBC肺转移灶释放的外泌体促进肺微转移灶的扩散
图2 肺转移性TNBC来源的外泌体促进肺微转移的扩散
3. LAP- TGF-β1作为功能性外泌体内容物促进TNBC肺微转移灶的扩散
为了分析肺转移灶外泌体在肺血管微环境重塑过程中引起的分子改变，作者利用RNA测序技术检测了暴露于PBS或231 LuT3外泌体的LuECs的基因表达谱。与PBS比较，231 LuT3外泌体预处理诱导了LuECs中转录本的改变，特别是Id1的转录水平升高和Tgfbr2的下调（图3A-B）。此外KEGG通路分析显示，231 LuT3外泌体处理的LuECs中与TGF-β相关通路的基因显著富集（图3C）。通过针对调控TGF-β信号关键基因的基因集分析（GSEA）进一步证实这一论点（图3D）。
TGF-β作为肿瘤微环境中重要的信号通路，在肿瘤内存在以TGF-β1激活为主的通路活性。为了确定231 LuT3外泌体中的TGF-β1蛋白，采用超高速离心和密度梯度离心相结合的方法，ELISA和Western blot分析均显示外泌体组分中存在TGF-β1，外泌体标志物HSP90、TSG101、CD63和CD9均呈阳性（图3E）。TGF-β1以活化（活化TGF-β1）和潜伏（LAP- TGF-β1）两种形式存在，通过盐酸酸化后再进行TGF-β1 ELISA检测可区分两种形式（图3F）。进一步对筛选后获得的肺转移灶外泌体中LAP- TGF-β1进行定量，结果显示231 LuT1、231 LuT2和231 LuT3外泌体中LAP- TGF-β1含量逐渐升高（图3G）。随后将231亲本、231 LuT1、231 LuT2和231 LuT3细胞接种到NCG-HLA-A2.1小鼠的第四乳腺脂肪垫中，4周后评估外泌体LAP- TGF-β1水平和肿瘤组织（图3H）。ELISA数据显示，与231亲本相比，231 LuT2和231 LuT3组血浆外泌体LAP- TGF-β1水平显著升高（图3I）。对231 LuT3肿瘤组织进行免疫荧光染色，发现CD63与LAP- TGF-β1的共定位明显高于231亲本肿瘤组织（图3J）。并且231 LuT3外泌体中LAP- TGF-β1含量显著高于231亲本外泌体，尽管细胞表达水平相反（图3K）。这些结果表明LAP- TGF-β1外泌体装载量的增加源于放大的主动转运机制，并非细胞过表达。此外。549 LuT3细胞和骨肉瘤肺转移灶细胞来源的外泌体表现出明显的LAP- TGF-β1表达，进一步证实了肺转移灶中升高的外泌体LAP- TGF-β1负荷与肿瘤微转移灶再肺内的扩散密切相关（图3L）。
图3 肺转移细胞外泌体中高LAP- TGF-β1蛋白水平
4. 外泌体LAP- TGF-β1驱动肺血管微环境重塑促进肺微转移灶扩散
为了阐明外泌体介导的肺微转移灶的扩散是否依赖于LAP- TGF-β1，作者利用CRISPR-Cas9靶向敲除肺转移灶231 LuT3细胞中的TGF-β1。探究了外泌体LAP- TGF-β1在肺血管微环境中的功能，PKH67标记的外泌体孵育24 h后观察到TGF-β1 KO对外泌体摄取没有影响（图4A）。外泌体处理LuECs 24 h后，TGF-β1 KO明显减轻TNBC肺转移灶外泌体对ZO-1蛋白表达的抑制作用，并阻碍外泌体诱导的高分子量右旋糖酐的外渗（图4B-C）。此外血管生成实验确定了外泌体LAP- TGF-β1在血管重塑中的作用。相对于231 LuT3 TGF-β1 WT外泌体，231 LuT3 TGF-β1 KO外泌体处理处理的LuECs形成的结节和管状结构减少，10 ng/ml的游离TGF-β1表现出与肺转移灶外泌体TGF-β1平行的作用（图4D）。小鼠静脉注射231 LuT3 TGF-β1 WT或231 LuT3 TGF-β1 KO外泌体，与WT相比，KO中TGF-β1缺失导致肺摄取效率降低了2.4倍（图4E）。此外，TGF-β1的缺失抑制了肺转移灶外泌体对肺血管完整性的恶化作用，表现为减少高分子量右旋糖酐的外渗和增加CD31+ECs中ZO-1蛋白的表达（图4F-G）。
为了确定外泌体LAP-TGF-β1和细胞分泌的TGF-β1对肺微转移扩散的影响，作者研究了游离的TGF-β1能否挽救231 LuT3 TGF-β1 KO细胞的外渗和定植能力。显微成像显示，经231 LuT3 TGF-β1 WT外泌体处理的LuECs表现出明显的外渗，而KO组外泌体处理未观察到这一现象（图5A-B）。这表明低剂量外泌体TGF-β1可以重塑肺血管微环境，最终促进外渗和定植。
为确定外泌体LAP-TGF-β1在体内对肺微转移扩散的影响，每隔一天用TGF-β1 WT或TGF-β1 KO来源的外泌体预处理小鼠三周，然后静脉注射231 LuT3细胞（图5C）。在注射后第5、10和15天，与TGF-β1 KO来源的外泌体处理相比，TGF-β1 WT来源的外泌体处理小鼠的肺转移明显增加（图5D）。并且TGF-β1 WT来源的外泌体小鼠中转移灶的数量和面积出现增加（图5E）。这些数据表明外泌体LAP- TGF-β1在体内定植早期阶段的促转移作用，显示外泌体LAP- TGF-β1可成为抗TNBC肺微转移扩散的治疗靶点。
图4 外泌体LAP- TGF-β1重塑肺血管内环境
图5 外泌体LAP- TGF-β1在肺微转移中的作用
5. LAP- TGF-β1与HSP90相互作用进入外泌体
鉴于LAP- TGF-β1在肺微转移灶外泌体中的显著富集，阐明其装载机制和潜在干预措施可成为解决肺转移扩散的创新策略。利用高表达外泌体LAP - TGF – β1的231 LuT3细胞，作者使用siRNA分别敲低了SDCBP (内居蛋白-1 )， PDCD6IP ( ALIX )，Rab7a，Rab27a和TSG101等与外泌体的生物发生，运输和释放有关的基因，敲除后导致231 LuT3外泌体中LAP- TGF-β1蛋白表达减弱，表明LAP- TGF-β1进入外泌体依赖于转运所需的内体分选复合物（ESCRT）途径。LAP- TGF-β1可通过与HSP90互作进入外泌体，为确定HSP90是否为LAP- TGF-β1分泌进外泌体所必需的，使用His-HSP90AA1转染231亲本细胞，显示外泌体内LAP- TGF-β1明显上调（图6B）。免疫共沉淀实验证实了HSP90A与LAP- TGF-β1的相互作用（图6C-D）。在231亲本细胞中，过表达HSP90AA1降低了LAP- TGF-β1与LC3B和GORASP2的结合，但增强了其与外泌体相关蛋白如内聚蛋白、ALIX、TSG101和CD63的结合（图6E）。表明HSP90A与LAP- TGF-β1的相互作用有利于其进入外泌体，同时减少其进入自噬体。当HSP90AA1被沉默后，外泌体LAP- TGF-β1的表达量显著下降，与外泌体相关蛋白的互作受阻（图6F-G）。免疫染色显示，HSP90A过表达促进了LAP- TGF-β1与CD63的共定位，但并未诱导LAP- TGF-β1向质膜转位（图6H-I）。这些结果表明，LAP- TGF-β1进入外泌体依赖于其与HSP90A的相互作用。
TGF-β1存在于外泌体膜上，外泌体膜上的货物从高尔基体转移到内体，在内体成熟过程中被分拣成多囊泡体，使用高尔基体标记物染色观察到过表达HSP90A的231亲本细胞的高尔基体中LAP- TGF-β1表达增强（图6J）。同时也促进了LAP- TGF-β1与早期内体标记物Rab5的共定位，共转染HSP90AA1和HA- LAP- TGF-β1，导致LAP- TGF-β1与晚期内体标志物Rab7的共定位增强（图6K-L）。这些结果表明，HSP90A与LAP- TGF-β1的相互作用影响了LAP- TGF-β1从高尔基体到内体的运输，最终导致其靶向外泌体。
图6 LAP- TGF-β1与HSP90相互作用引导高尔基体向内体转运
6. LAP- TGF-β1与组蛋白乙酰转移酶TIP60在K304残疾的相互作用促进TNBC肺微转移病灶的扩散
为进一步验证LAP- TGF-β1、HSP90A和外泌体相关蛋白之间的相互作用，对LAP- TGF-β1进行不同截短，并研究它们与HSP90A和外泌体蛋白的共沉淀（图7A），IP结果显示，缺失TGF-β1结构域的LAP-TGF-β1与HSP90A和相关蛋白的互作减弱（图7A）。考虑到HSP90A通过其KFERQ-like基序促进非常规蛋白分泌的能力，且KFERQ序列一般由5个残基组成，我们对LAP-TGF-β 1蛋白序列的检测发现TGF-β 1结构域中存在一个非典型乙酰化的KFERQ-like基序( 300IDFRK304 )。为验证这种乙酰化修饰的存在，作者检测了HDAC家族去乙酰化酶光谱抑制剂曲古霉素A（TSA）和SIRT家族去乙酰化酶烟酰胺（NAM）处理的231亲本细胞中异位表达的LAP-TGF-β1的乙酰化情况，结果显示出现乙酰化；与NAM处理细胞相比，TSA处理的231亲本细胞显示出增强的LAP-TGF-β 1与HSP90A和外泌体相关蛋白的结合（图7B）。这些结果显示LAP-TGF-β1的乙酰化修饰可能驱动其进入外泌体。
随后将R303K304残基替换为丙氨酸，检测突变体与HSP90A的互作，在231亲本细胞中R303A/K304A突变显著降低了其与HSP90A和外泌体蛋白的结合（图7C）。为了鉴定负责LAP-TGF-β1 K304位点乙酰化的乙酰转移酶，我们检测了几个主要的候选蛋白，包括GCN5，PCAF，TIP60，CBP和p300。在231亲本细胞中异位表达的TIP60显示出与LAP-TGF-β1的强特异性关联（图7D）。接下来，作者研究了LAP-TGF-β1乙酰化是否需要TIP60。在231 Lu T3 TGFB1 KO1细胞中，乙酰转移酶缺失的TIP60（TIP60-DN）使LAP-TGF-β1与TIP60的相互作用消失，表明LAP-TGF-β1向外泌体的乙酰化定向分选是由TIP60协同完成的（图7E）。
LAP-TGF-β1 R303A/K304A突变显著降低了过表达LAP-TGF-β1和HSP90AA1的231 LuT3 TGF-β1 KO细胞外泌体对细胞外渗和定植的外泌体诱导作用，并增加了LuECs中ZO-1的表达，LAP-TGF-β1 K304Q突变增强了这些作用（图7F-G）。总之，这些结果表明，LAP -TGF-β1通过与HSP90A结合被装载到外泌体中，由TIP60调节的KFERQ样基序( 300IDFRK304 )的乙酰化介导。这导致了肺血管微环境的重塑，从而增强了肺微转移病灶的扩散。
图7 TIP60驱动的LAP -TGF-β1 K304乙酰化促进肺转移扩散
7. 双重抑制HSP90A和TIP60有效阻碍TNBC肺转移的扩散
HSP90A和TIP60驱动LAP -TGF-β1进入外泌体，作者从用靶向HSP90A或TIP60（17-AAG和NU9056）的抑制剂处理的231 LuT3细胞中收集外泌体。ELISA显示17-AAG/NU9056均导致外泌体中LAP -TGF-β1蛋白水平降低（图8A）。为了研究HSP90A和TIP60抑制剂对TNBC肺微转移扩散的联合作用，作者通过尾静脉注射17-AAG/NU9056处理的231 LuT3细胞来源的外泌体，每周2次，共3周，随后接种231 LuT3细胞（图8B）。与PBS相比，在注射231 LuT3GFP-Luc细胞后的第5、10和15天，小鼠肺内增强的BLI信号显示外泌体促进的肺转移在17-AAG/NU9056联合处理后显著抑制（图8C）。全肺成像显示，该组合显著减少了外泌体增加的肺转移病灶的数量和大小（图8D）。总的来说，这些研究结果首次报道了在非细胞毒性条件下，双重抑制HSP90A和TIP60显著降低了LAP -TGF-β1外泌体的载量，有效减少了肺微转移病灶的扩散。
图8 双重抑制HSP90A和TIP60可抑制TNBC肺微转移
研究总结
肺微转移灶外泌体上的LAP-TGF-β1通过TIP60介导在其K304位点发生乙酰化，导致其与HSP90A相互作用，促进其从高尔基体转运至内体，产生LAP-TGF-β1高表达的外泌体，重塑肺血管微环境，最终促进TNBC肺微转移灶的扩散。阐明了LAP-TGF-β1在TNBC肺微转移扩散中的作用以及LAP-TGF-β1外泌体转运的潜在过程，从而为靶向治疗TNBC肺转移提供一种可行途径。
图9 LAP-TGF-β1乙酰化在TNBC肺微转移中的作用
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