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代谢失衡，特别是脂质代谢失衡，是糖尿病性心肌病（DbCM）的关键特征，可导致心肌重塑和心脏功能障碍。维持心肌代谢平衡是DbCM的主要治疗策略。在糖尿病中，胰岛素抵抗和循环游离脂肪酸（FFA）升高会促进脂肪酸摄取并触发细胞内脂质积累。冗余的脂肪酸引起细胞脂毒性并破坏能量供应，对DbCM的心脏功能障碍有重要作用。Takeda G蛋白偶联受体5（Takeda G蛋白偶联受体5，TGR5）是一种主要的胆汁酸受体，有研究报道，TGR5与代谢调节和心肌保护有关。然而，胆汁酸-TGR5通路在维持心脏代谢稳态中的确切作用尚不清楚。
2024年5月2日，北京大学徐明及姜长涛团队在Nature Metabolism发表了题为“Inhibition of fatty acid uptake by TGR5 prevents diabetic cardiomyopathy”的研究论文，通过代谢组学分析、免疫共沉淀和基因编辑等技术发现TGR5-DHHC4途径可调节心脏脂肪酸摄取，提供了靶向TGR5治疗糖尿病性心肌病的新思路。
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首先，作者通过使用高脂饮食（HFD）与低剂量链脲佐菌素（STZ）联合处理（以下简称HFD/STZ）24周构建了DbCM小鼠模型（图1a），研究其胆汁酸代谢的变化。结果显示DbCM小鼠血浆和心脏组织中脱氧胆酸（DCA）水平降低（图1b-c）。为了探索DCA受体TGR5在DbCM中的作用，作者使用心脏特异性TGR5敲除（αMHC-Gpbar1fl/fl；TGR5ΔCM）小鼠构建了HFD/STZ诱导的DbCM模型。超声心动图结果显示，与TGR5fl/fl小鼠相比，TGR5ΔCM小鼠的整体纵向应变（GLS）、射血分数（EF）和缩短分数（FS）降低，E/E′比增加，心脏收缩和舒张功能障碍更严重（图1d-h）。此外，作者使用db/db；αMHC-Gpbar1fl/fl（db/db TGR5ΔCM）小鼠构建了DbCM模型，结果与HFD/STZ诱导的DbCM模型一致。为了探索TGR5如何介导糖尿病患者的心脏保护作用，作者对DbCM小鼠的心脏组织进行了形态学及分子生物学研究。与之前的报道一致，DbCM小鼠的心脏心肌肥大和纤维化的特征明显，包括心肌细胞面积增大，心房利钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）和肌球蛋白重链7（β-MHC）的蛋白水平升高，以及胶原纤维的积聚增强（图1i-m）。以上结果表明，心脏特异性TGR5敲除会加剧HFD/STZ或db/db背景诱导的DbCM。![]()
图1
为了进一步了解DbCM小鼠心脏功能障碍表型的潜在机制，作者评估了其脂质代谢水平。油红O染色、BODIPY 493/503染色（脂滴探针）和TG检测结果显示，与HFD/STZ TGR5fl/fl小鼠或db/db小鼠相比，TGR5ΔCM小鼠心肌内脂质的积聚增加（图2a-d）。用棕榈酸（PA）和油酸（OA）处理后，TGR5ΔCM原代新生小鼠心肌细胞（NMCM）中的脂滴显著增加（图2e）。透射电子显微镜（TEM）结果进一步显示，TGR5ΔCM小鼠脂滴的数量和大小增加（图2f-h）。此外，与TGR5fl/fl小鼠相比，糖尿病小鼠TGR5ΔCM心肌组织的脂质组学分析结果显示出不同的脂质组谱，其FFA、二酰甘油（DG）和TG水平显著升高（图2i-j），且TGR5ΔCM小鼠的长链不饱和脂肪酸显著增加（图2k）。以上结果表明，TGR5敲除促进心肌脂质的积聚。![]()
图2
为了进一步评估TGR5对心脏脂毒性的影响，作者使用TGR5激动剂INT-777灌胃db/db小鼠12周。INT-777改善了db/db小鼠心脏的收缩和舒张功能，对db/db TGR5ΔCM小鼠则没有效果（图3a-e）。此外，INT-777显著抑制了db/db小鼠的心肌细胞肥大和纤维化，对db/db TGR5ΔCM小鼠几乎没有作用（图3f-h）。油红O染色和BODIPY 493/503染色结果显示，INT-777减少了db/db小鼠的心脏脂质积聚，而INT-777对db/db TGR5ΔCM小鼠的脂质代谢没有显著影响（图3f-j）。这些结果表明，心脏TGR5的激活可能抑制心肌脂质的积聚。此外，INT-777处理后，NMCM的FFA、DG和TG水平显著降低（图3k-i），FFA物种分析显示其长链脂肪酸显著减少（图3m）。以上结果表明，TGR5可能是一个潜在的治疗靶点，激活TGR5可以预防心脏脂毒性和心功能障碍。![]()
图3
接下来，作者对小鼠的脂肪酸摄取和FAO进行了评估。为了研究TGR5对脂肪酸运输到心脏的影响，作者检测了小鼠心肌组织对静脉注射BODIPY荧光结合脂肪酸的摄取（图4a）。与TGR5fl/fl小鼠相比，TGR5ΔCM小鼠的心肌组织对脂肪酸的吸收增加，特别是长链脂肪酸（图4b）。INT-777处理db/db小鼠可导致长链脂肪酸的摄取减少（图4c）。用NMCM进行的体外实验证实了TGR5对脂肪酸摄取的抑制作用（图4d-e）。CD36是心脏中长链脂肪酸摄取的主要介质，它依赖于质膜（PM）上的表达和定位来实现其功能。因此，作者检测了CD36在DbCM小鼠心脏中总蛋白和膜蛋白的表达水平。CD36的总蛋白水平在TGR5ΔCM和TGR5fl/fl小鼠之间没有显著差异（图4f）。然而，与TGR5fl/fl小鼠相比，TGR5ΔCM小鼠PM定位的CD36水平升高（图4g-h）。在TGR5ΔCM小鼠的原代NMCM和经INT-777处理的NMCM中，诱导PA+OA导致TGR5ΔCM细胞中CD36的PM定位增加，证实了体内研究结果（图4i）。CD36可募集Src家族激酶Fyn和Lyn来组装信号蛋白复合物，以激活下游信号通路。因此，作者研究了TGR5是否参与调节CD36-Fyn-Lyn复合物的形成。在PA+OA处理的NMCM中，TGR5敲除显著增加了CD36免疫沉淀中Fyn和Lyn的表达，而INT-777处理逆转了这些影响（图4j-o）。这些数据表明TGR5抑制了CD36-Fyn-Lyn复合物的组装。以上发现部分证实了TGR5抑制脂肪酸摄取和CD36的PM定位。![]()
图4
5. TGR5-DHHC4信号调节CD36棕榈酰化
棕榈酰化可增强蛋白质的亲脂性，在调节蛋白质的亚细胞分布和功能方面发挥着重要作用。鉴于棕榈酰化与膜蛋白的PM定位有关，作者使用酰基生物素交换（ABE）测定法研究了DbCM小鼠心脏蛋白质中CD36棕榈酰化的水平。结果显示，TGR5ΔCM小鼠和db/db TGR5ΔCM小鼠的CD36棕榈酰化水平升高（图5a-b）。此外，作者还研究了INT-777对CD36棕榈酰化的影响。与对照小鼠相比，用INT-777处理显著降低了CD36棕榈酰化水平（图5c）。为了检测CD36棕榈酰化对心肌细胞中脂肪酸摄取和脂质积累的影响，作者使用2-溴棕榈酸（2-BP，一种已知的棕榈酰酰基转移酶抑制剂）阻断棕榈酰化（图5d）。结果显示，棕榈酰化的抑制显著降低了心肌细胞中的脂肪酸摄取和脂质积累（图5e-f）。这些发现表明TGR5可抑制CD36的棕榈酰化。蛋白质的棕榈酰化由一组含有锌指DHHC结构域的棕榈酰酰基转移酶（DHHCs）催化，其在半胱氨酸残基的巯基上添加了一个棕榈酰基团。由DHHC4和DHHC5介导的CD36棕榈酰化主要负责其在PM上的定位和随后的脂肪酸摄取。为了鉴定参与TGR5途径的潜在棕榈酰酰基转移酶，作者通过免疫共沉淀研究了CD36与DHHC4或DHHC5之间的相互作用。结果显示，TGR5敲除增强了CD36和DHHC4之间的结合，但对CD36和DHHC5之间的结合没有影响（图5g-h）。用INT-777处理显著抑制了CD36和DHHC4表达之间的关联（图5i）。为了进一步评估TGR5和DHHC4之间的相关性，作者使用siRNA敲除了PA+OA刺激的NMCM中的DHHC4。结果显示siDHHC4显著减少了CD36的棕榈酰化（图5j）。此外，在TGR5敲除的心肌细胞中，DHHC4沉默显著降低了CD36的棕榈酰化，这表明TGR5对CD36棕榈酰化的影响依赖于DHHC4（图5j）。这些数据表明，TGR5-DHHC4信号介导心肌细胞中的CD36棕榈酰化。![]()
图5
6. DHHC4敲低改善了TGR5缺失小鼠的心脏功能障碍
为了进一步评估DHHC4在体内的作用，作者通过尾静脉输注AAV9-cTNT-DHHC4构建了心肌细胞特异性DHHC4敲低小鼠（图6a）。超声心动图显示，DHHC4敲低有效改善了HFD/STZ诱导的心功能障碍，并逆转了TGR5缺失小鼠的心功能损伤（图6b-f）。此外，DHHC4敲低后HFD/STZ诱导的心肌脂质积聚显著减少（图6g-i）。在分子水平上，DHHC4敲低导致CD36在心脏中的棕榈酰化和PM定位减少（图6j-m）。在功能上，DHHC4敲低导致脂肪酸摄取显著减少（图6n）。这些发现表明，TGR5缺失对脂质积聚增加和心脏功能障碍的影响依赖于DHHC4。![]()
图6
为了研究糖尿病心肌损伤相关胆汁酸水平的潜在变化，作者使用胆汁酸靶向代谢组学方法对健康参与者以及患有左心室肥大（LVHT）或心力衰竭（HF）的2型糖尿病（T2DM）参与者的血浆胆汁酸进行了全面分析。分析结果揭示了特定胆汁酸的显著变化，特别是TGR5偏向性的DCA和TCA。与健康参与者相比，糖尿病LVHT患者的DCA水平降低，而糖尿病HF患者的DCA水平进一步降低（图7a）。考虑到患有糖尿病的女性更容易患心肌病和HF，作者按性别划分了胆汁酸谱。在男性和女性参与者中，患有糖尿病LVHT和糖尿病HF的参与者的DCA水平显著降低，但性别之间没有显著差异（图7b-d）。此外，相关性分析结果表明，血浆DCA水平与N-末端B型利钠肽前体水平之间呈负相关（图7e），而DCA水平和EF之间呈正相关（图7f）。总之，这些发现强调了胆汁酸-TGR5途径在DbCM发展中的作用及其作为DbCM诊断标志物的潜力。![]()
图7
综上所述，TGR5抑制心脏脂肪酸的摄取和脂质积累。这些结果在用TGR5激动剂INT-777或胆汁酸去氧胆酸（DCA）和牛磺胆酸（TCA）治疗的小鼠中得到了进一步验证。TGR5敲除促进了CD36的棕榈酰化和膜定位，这一过程由棕榈酰转移酶DHHC4介导。在DHHC4敲低后，TGR5敲除诱导的心肌功能异常得到逆转。值得注意的是，在糖尿病性心肌损伤患者中，TGR5调节的胆汁酸，尤其是DCA，被发现受到抑制。这些研究发现了TGR5-DHHC4途径是改善DbCM脂质代谢的关键介质，为DbCM提供了潜在的治疗策略。
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