高脂饮食（High-fat diet, HFD）通过破坏肠道菌群作为癌症恶性进展的高危险因素。然而，HFD相关的肠道菌群在癌症发展中的作用尚不清楚。本研究聚焦于此，发现肥胖及肥胖相关的肠道菌群与女性乳腺癌患者的不良预后和晚期临床病理状态相关。HFD相关菌群通过产生多形核髓系衍生抑制性细胞（PMN-MDSCs）促进癌症进展。机制上，HFD菌群介导产生的亮氨酸可以激活mTORC1信号通路，促进PMN-MDSC分化。最终通过“肠-骨髓-肿瘤”轴促进乳腺癌进展。
2024年5月6日，中山大学附属第六医院结直肠外科的科学家在Proc Natl Acad Sci U S A（IF：11.1）杂志上发表题目为“A high-fat diet promotes cancer progression by inducing gut microbiota-mediated leucine production and PMN-MDSC differentiation”的文章，通过16S rRNA基因测序、代谢组学分析等技术发现了HFD相关肠道菌群通过激活多形核髓源性抑制细胞（Polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells, PMN-MDSC）产生亮氨酸促进癌症进展；机制上，HFD菌群产生大量亮氨酸激活髓系祖细胞中mTORC1信号通路，促进PMN-MDSC分化，这些发现揭示了“肠道-骨髓-肿瘤”轴参与HFD介导的癌症进展，并且靶向肠道菌群的异常代谢可为抗癌治疗策略提供新途径。
主要内容
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1. HFD通过肠道菌群失调促进肿瘤进展
作者首先利用Kaplan-Meier（KM）曲线，结果显示在5031例乳腺癌患者中，体重指数（BMI）≤24（n=3829）的患者比BMI＞24（n=1202）的患者总生存期和无病生存期更长（图1A-B）。此外，受试者相关特征ROC曲线分析显示，BMI预测乳腺癌患者的局部复发情况（图1C）。结果表明肥胖通过促进肿瘤生长与乳腺癌患者的不良预后相关。采用16S rRNA基因测序对61例女性乳腺癌患者的肠道菌群进行检测，发现与BMI≤24（n=41）的比较，BMI＞24（n=20）的女性患者粪便中真杆菌属、脱硫弧菌属和红螺菌属显著增加；相反BMI＞24的患者粪便中genera Feacalimonas、Solobacterium和Gemella菌属丰度显著降低（图1D）。值得注意的是，大多数肠道菌群，包括脱硫弧菌属和红螺菌属，在BMI＞24的患者中比例升高，属于变形菌门家族，在肥胖患者中丰度高。此外，在这些患者中脱硫弧菌属的丰度与肿瘤大小和Ki67阳性呈正相关（图1E）。以上结果显示和肥胖相关的肠道菌群与乳腺癌患者肿瘤生长和不良预后之间的相关性，表明肠道菌群发生变化在肥胖诱导的癌症发展中至关重要。
利用MMTV/PyMT小鼠构建正常脂肪饮食（normal-fat diet, NFD）、高脂饮食HFD、NFD菌群移植（NFDMT）和HFD菌群移植（HDFMT）模型，评估肥胖相关肠道菌群在乳腺癌进展中的作用（图1F）。观察发现与NFD和NFDMT相比，HFD和HDFMT均显著加快了小鼠乳腺肿瘤的进展（图1G-H）。因此，对HFD和HDFMT小鼠喂抗生素混合物以消除HFD介导的肠道菌群变化（图1I，L），结果表明抗生素灌胃减弱了HFD和HDFMT对乳腺肿瘤的促进作用（图1J-K，M-N）。这些结果揭示了HFD通过肠道菌群失调促进肿瘤进展。
图1 高脂饮食通过肠道菌群失调促进肿瘤进展
2. HFD介导的肠道菌群失调通过PMN-MDSC促进肿瘤进展
在饮食喂养结束后收集小鼠粪便，进行16s rRNA基因测序，进一步探索参与增强肿瘤生长的肠道菌群菌属。数据显示，NFD和HFD小鼠肠道菌群主要由bacterium_Bacteroidales_S24-7_ group、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Bacteroides（图2A）。LEfSe分析发现，与NFD小鼠相比，HFD小鼠genera Feacalimonas、Desulfovibrio、bacterium_Ruminococcaceae、Ruminiclostridium和Ruminiclostridium_9和bacteriumf BacteroidalesS24-7roup, Lachnospiraccae_NK4A136_group和Alloprevotella显著减少（图2B）。HFD相关肠道菌群改变了肿瘤微环境，特别是免疫细胞，进而影响癌症进展。对肿瘤组织中免疫细胞进行筛选发现，与NFD小鼠相比，MDSCs在HFD和HDFMT小鼠乳腺肿瘤组织和血液循环中的数量显著增加（图2C-D）。MDSCs在骨髓中生存并迁移到肿瘤病灶中，塑造免疫抑制微环境，在表型上，MDSCs主要分为单核MDSCs和多核MDSCs，研究发现NFD、HFD和HDFMT荷瘤小鼠MDSCs抑制CD3＋T细胞增殖（图2E-F）。并且MDSCs表达免疫抑制标志物S100A8、S100A9、ARG-1和VEGF高于正常小鼠（图2G）。与NFD相比，HFD和HDFMT组肿瘤和血液循环中的PMN-MDSCs均显著升高（图2H-I），这种升高现象可被抗生素灌胃逆转（图2J-M）。使用抗Gr-1和抗Isotype抗体研究HFD介导的肠道菌群是否通过MDSCs促进肿瘤生长，表明在HFD和HDFMT小鼠中显著阻碍了乳腺肿瘤的生长（图2N-O）。以上结果表明HFD相关的肠道菌群通过MDSCs促进肿瘤进展。
图2 HFD介导的肠道菌群失调通过PMN-MDSCs促进肿瘤进展
3. HFD介导的肠道菌群失调促进PMN-MDSC产生
接下来，作者进一步探索HFD和相关肠道菌群导致肿瘤和血液循环中PMN-MDSCs增加的具体原因。MDSCs来源于骨髓中的MPs，骨髓中的普通MPs（CMPs）产生巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs）或粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs），在癌症中分化为MDSCs。在集落刺激因子CSF的刺激下，通过血液循环响应CXCL1和CXCL12等趋化因子被招募到肿瘤中（图3A）。与NFD相比，HFD和HDFMT中GMP群体数量增加（图3B-C），抗生素处理降低这种比例（图D-G）。这些结果支持了HFD介导的肠道菌群失调促进骨髓中MP向GMP分化的假说。
此外，作者使用NFD、HFD或HDFMT来源血清处理对照小鼠的MP细胞。值得注意的是，与NFD相比，HFD和HDFMT小鼠的血清均促进MP细胞向MDSCs分化（图3H-I），尤其是PMN-MDSCs（图3K-L），并且高表达MDSCs特异因子（图3J）。另外抗生素灌胃的HFD小鼠来源血清不能诱导MP细胞向MDSCs分化（图3N-O），尤其是PMN-MDSCs（图3P-Q）。以上结果表明HFD和HDFMT小鼠中的MDSCs数量增加是由于血清中特定因子诱导骨髓中MP细胞向MDSCs分化增强。
图3 HFD介导的菌群失调触发PMN-MDSC的产生
4. HFD介导的优势微生物产生亮氨酸促进PMN-MDSC分化和肿瘤进展
作者使用质谱分析了饮食喂养小鼠粪便中96种宿主微生物代谢产物水平。PLS-DA分析显示，HFD小鼠与NFD小鼠的粪便代谢物组成有30种存在显著差异（图4A），其中支链氨基酸包括L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，在HFD来源粪便中的水平显著高于NFD（图4A-B）。此外，HFD和HDFMT组血清中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的浓度显著高于NFD（图4C）。使用MetaboAnalyst生成的拓扑图显示，缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的生物合成出现显著上调（图4D）。粪便中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的含量与HFD小鼠中丰度增加的菌属（脱硫弧菌属）呈显著正相关（图4E）。相反抗生素给药HFD或HDFMT小鼠会导致粪便中亮氨酸和异亮氨酸，血清中亮氨酸和缬氨酸水平降低（图4F-G）。这些结果说明支链氨基酸水平升高可归因于HFD介导的优势肠道菌群所产生。
亮氨酸灌胃显著促进乳腺肿瘤的进展（图4H-J），增加了肿瘤浸润和血液循环PMN-MDSCs水平（图4K-L）和骨髓中GMPs水平（图4M-N）。以上结果表明，HFD通过增加由HFD介导的优势肠道菌群产生的亮氨酸来诱导MDSCs的产生和肿瘤进展。
图4 HFD介导的优势菌群产生亮氨酸以促进PMN-MDSC的增殖和肿瘤进展
5. HFD介导的脱硫弧菌属富集通过亮氨酸的产生增加PMN-MDSCs的产生和癌症进展
作者为了直接检测HFD富集的脱硫弧菌属的调节作用，对无菌小鼠进行灌胃处理，随后进行了原位4T1乳腺癌细胞移植（图5A）；结果显示，该菌属显著加速了4T1荷瘤小鼠的肿瘤生长（图5B-C）。这些结果表明D. 脱硫螺菌在HFD的粗肿瘤过程中至关重要。此外，D. 脱硫螺菌灌胃提高了肿瘤和血液循环中MDSC的水平（图5D-E），尤其是PMN-MDSC（图5F-G），以及骨髓中GMP水平（图5H-I）；以及增加了粪便中亮氨酸水平（图5J）。这些结果显示在HFD中富集的脱硫弧菌属可以产生额外的亮氨酸来触发MDSCs的产生和癌症进展。
图5 HFD介导的脱硫弧菌属通过产生亮氨酸促进PMN-MDSC产生和癌症进展
6. 亮氨酸通过激活mTORC1信号通路诱导MPs向PMN-MDSCs分化
在MPs中，与NFD和HFD+A组相比，HFD、HDFMT和NFD+L组小鼠的mTOR信号被高度激活（图6A）；并且体外实验中亮氨酸以剂量依赖的形式激活MPs中的mTORC1信号通路（图6B）。此外，伊维莫斯抑制mTORC1后，阻碍了HFD，HDFMT和NFD+L小鼠血清中MDSC的生成（图6C-D）。伊维莫斯体内治疗降低了骨髓中循环MDSCs（图6E-F），尤其是PMN-MDSCs（图6G-H）和GMPs（图6I-J）水平，同样减缓了HFD、HDFMT和亮氨酸灌胃小鼠的乳腺肿瘤进展。以上结果表明，HFD介导的菌群亮氨酸通过MPs中的mTORC1信号通路促进MDSC的产生。
图6 亮氨酸通过激活mTORC1信号通路诱导MP向PMN-MDSCs分化
7. 血清亮氨酸和HDF相关菌群与乳腺癌患者的肿瘤MDSCs和晚期临床病理状态相关
最后，作者试图证实HFD相关菌群与乳腺癌进展之间的相关性。分析了181例女性患者血清，血清亮氨酸与乳腺癌患者的BMI和肿瘤Ki67水平呈正相关（图7A）。与良性肿瘤携带者相比，乳腺癌患者的血清亮氨酸水平显著升高（图7B），KM曲线显示低血清亮氨酸水平与更长DFS和更低的乳腺癌复发相关（图7C-D）。此外检测了61例女性乳腺癌患者的粪便亮氨酸水平，进一步表明亮氨酸水平的增加来源于肥胖相关的肠道菌群（图7E）。
此外为了阐明肿瘤浸润的MDSC与乳腺癌患者肥胖和相关肠道菌群之间的关系，作者对人乳腺癌组织中的MDSCs进行了免疫染色，结果显示与BMI≤24的相比，肥胖患者的乳腺癌组织中CD33+ MDSCs显著增加（图7F-G）。这些MDSCs与血清亮氨酸水平、脱硫弧菌属呈正相关（图7H-I）。与低亮氨酸水平的相比，高亮氨酸水平的血清显著激活了MPs中mTOR信号通路，并在体外诱导MDSC的产生（图7J）。16s rRNA测序显示接受肥胖捐献者FMT的小鼠比正常的小鼠脱硫弧菌属更富集。移植来自肥胖供体而非正常体重供体的粪便促进了小鼠乳腺癌的生长，并增加了肿瘤和循环MDSCs，尤其是PMN-MDSCs（图7K-L）。
这些结果表明，HFD相关微生物亮氨酸激活骨髓中MP mTORC1信号通路，触发MP繁殖和PMN-MDSC分化，最终通过肠-骨髓-肿瘤轴促进乳腺癌进展（图7M）。
图7 血清亮氨酸和HFD相关菌群与乳腺癌患者肿瘤MDSCs和晚期临床病理状态相关
研究总结
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总的来说，本研究揭示了HFD介导的肠道菌群产生的额外亮氨酸，随后骨髓中MPs mTORC1信号通路激活和PMN-MDSC分化的触发，最终通过肠道-骨髓-肿瘤轴促进乳腺癌的进展。
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