主要：
生物膜被划分为称为膜微结构域的功能区，其中包含特定的脂质和蛋白质.膜微结构域的组成和组织仍然存在争议，因为很少有技术可以在不破坏其天然行为的情况下原位观察脂质.酵母内异体由 BAR 结构域蛋白 Pil1 和 Lsp1（以下简称 Pil1/Lsp1）组成，形成一个膜隔室，该隔室通过压平和释放隔离因子来感应和响应机械应力.在这里，我们分离出近天然的内异小体，这些小管由与质膜脂质结合的 Pil1/Lsp1 晶格组成，并通过螺旋重建解析它们的结构。我们的结构揭示了膜脂质的显着组织，并且使用体外重构和分子动力学模拟，我们确认了单个 PI（4,5）P 的位置2、磷脂酰丝氨酸和甾醇分子被隔离在 Pil1/Lsp1 涂层下。天然来源内异体的三维变异性分析揭示了 Pil1/Lsp1 晶格的动态拉伸，这影响了这些脂质的隔离。总的来说，我们的结果支持一种机制，其中 Pil1/Lsp1 晶格的拉伸释放了原本会被 Pil1/Lsp1 涂层锚定的脂质，从而为内isosome BAR 结构域蛋白如何创建机械敏感膜微结构域提供了机制见解。
图 1：天然来源的内异体保留了未受干扰的质膜微结构域。
图 2：甾醇在 MCC-内异糖体膜微结构域内被 Pil1/Lsp1 AH 稳定。
图 3：用已知成分的脂质重构纯化的 Pil1 能够识别结构特征。
图 4：损害脂质结合的突变会影响体内 MCC-内异体的形态和功能。
图 5：三维变异性分析揭示了 Pil1/Lsp1 晶格拉伸及其对天然来源 MCC-间泌体内膜组织的影响。
冷冻电镜网格制备和数据收集
将 5 μL 新鲜样品涂在铜网网格 （Jena Bioscience X-170-CU400） 上未经处理的花边碳膜上，印迹 3-4 秒，然后重新涂覆，印迹 2-4 秒（第二次印迹），最后在 Leica GP2 浸入系统中在 18 °C、90% 湿度下冷冻。
使用 SerialEM 对装有 Gatan K2 Quantum 直接电子检测器（海德堡）的 300 kV Titan Krios 进行靶向采集，对天然来源的内异体丝进行成像。共收集 2,827 部电影，每部电影的总剂量为 40 e−Å−2，目标散焦范围为 -0.8 至 -1.8 μm，像素尺寸为 1.327 Å（放大倍率 105,000×）。
使用 EPU v.2.14 软件、300 kV Titan Krios 和 Falcon 4 直接检测器 （DCI Lausanne） 对重构的 Pil1 细丝进行成像。收集了三个数据集：（1） Pil1 + 'minus PI（4,5）P2' 脂质体（21,386 部电影）;（2） Pil1 + “减去胆固醇”脂质体（22,960 部电影）;和 （3） Pil1 + 'PI（4,5）P2/cholesterol' 脂质体（22,408 部电影）。对于每部电影，总剂量为 50 e−Å−2，目标散焦范围为 -0.6 至 -1.8 μm，像素尺寸为 0.83 Å（放大倍率 96,000×）。
结论
总之，我们的观察结果提供了明确的证据，证明内异体支架蛋白 Pil1 和 Lsp1 通过与特定脂质的直接相互作用形成质膜微结构域。我们的工作为该微域内质膜脂质的组织和动力学提供了高水平的细节。此外，我们的数据使我们能够为这些 MCC-内异体微结构域如何感知和响应机械应力提出一个推测模型。
尽管 Pil1/Lsp1 晶格能够在没有 PI（4,5）P 的情况下在膜表面自组织2，我们发现 PI（4,5）P2对于稳定胞质小叶内的 AH 是必需的。当 PI（4,5）P2结合并插入 AH，甾醇的半稳定相互作用（主要与 AH 的大块侧链）能够形成，并且膜微结构域内其他脂质（可能还有 MCC-间泌体驻留蛋白的迁移率，例如 Nce102）的迁移率降低。在存在 PI（4,5）P 的情况下2和甾醇，Pil1 和 PS（包括 PS 的酰基尾部）之间发生特异性稳定的相互作用，这表明 PS 酰基尾部轮廓可能在这些相互作用中发挥作用。值得注意的是，我们观察到的稳定脂质相互作用仅限于细胞质小叶，在小叶内脂质动力学中显示出明显的膜不对称性。
在机械应力下，Pil1/Lsp1 晶格拉伸可以通过 Nt 晶格接触位点和 AH 之间的直接连接传达给细胞质小叶中的脂质。在我们的天然源结构中，我们看到 Pil1 晶格拉伸与 PI（4,5）P 的动员相关2和 PS 以及细胞质小叶内甾醇模式的缺失（图 D）。5e），这意味着 MCC-间小体内所有脂质的迁移率增加。鉴于我们所有的 Pil1 脂质结合口袋突变体 - 即使是那些具有轻度形态缺陷的突变体 - 都表现出张力反应蛋白 Nce102 的错误定位，我们提出这种脂质动员代表了一种释放隔离因子以启动其对膜应激敏感的信号传导功能的一般机制
