疫病一直以来都是困扰畜禽产业高质量、稳定发展的难题之一，动物疫病不仅造成了巨大经济损失，同时人畜共患疾病也严重威胁人类健康。单细胞测序技术为畜禽抗病育种提供了新的思路和解决方案，基于单细胞技术深入分析畜禽的病原感染机制，揭示宿主免疫反应，对畜禽抗病育种具有重意义。
今天，小格要与大家分享的是2024年发表在PNAS上题为“Single-cell profiling of African swine fever virus disease in the pig spleen reveals viral and host dynamics”的研究论文。本篇文章深入研究了非洲猪瘟病毒(ASFV)在猪体内感染过程中的主要靶细胞，并探讨了病毒如何在这些靶细胞内实现长期感染。
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文章简介
非洲猪瘟是一种对全球养猪业构成巨大威胁的疾病，但目前人们对非洲猪瘟病毒（ASFV）在猪体内真实感染环境中的靶细胞及其长期感染机制知之甚少。本文采用了单细胞测序技术，并结合了流式细胞术、免疫荧光等多种技术手段，对ASFV在脾脏细胞中的动态变化、细胞嗜性、免疫应答调控、抗病毒反应规律以及长期感染机制进行了全面研究。
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技术路线
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研究结果
1、病毒在多个器官的迅速传播，通过qPCR锁定病毒载量最高的器官，选取关键时间节点，进行单细胞转录组测序。
对肌肉注射指定剂量的ASFV，病毒迅速传播到猪的多个器官，在指定时间进行解剖，通过qPCR明确脾脏表现出最严重的病理表现和最高的病毒载量。选取感染ASFV后0天、3天、5天和7天的猪脾脏样本进行scRNA-seq，分别捕获到19,465、12,064、9,131、9,264个细胞（三次生物学重复），并划分出七个主要的细胞类型。
2、通过对ASFV感染期间不同时间节点脾脏样本细胞类型占比情况分析，锁定单核细胞和巨噬细胞是ASFV感染的主要细胞类型。
ASFV感染期间脾脏中细胞类型组成的动态变化表明：NK细胞和巨噬细胞的相对比例在3至7天感染期间急剧下降了1.5倍以上，单核细胞的数量则随着病情恶化增加了5倍以上。通过流式细胞术（FACS）验证了单核细胞和巨噬细胞在感染期间的动态变化。
在ASFV感染过程中，利用scRNA-seq技术将携带病毒mRNA的细胞群分为（低、中、高）三种病毒载量状态，单核细胞和巨噬细胞内的病毒载量最高。在感染后的第5天和第7天，研究猪脾脏来源细胞中每种细胞类型的感染细胞百分比，单核细胞和巨噬细胞是ASFV感染的主要细胞类型，尤其是在单核细胞中观察到最高比例的病毒感染细胞（57.4%）。
3、在感染过程中，不同细胞类型对病毒的感染状态和抗病毒基因的表达水平各不相同。研究ASFV感染的单核细胞和巨噬细胞后的抗病毒感染机制。
研究表明，猪干扰素可有效抑制ASFV复制。在ASFV感染后的单核细胞和巨噬细胞中，干扰素（IFN）及干扰素刺激基因（ISGs）的表达水平显著低于邻近未感染细胞，且ISG基因表达与病毒载量之间存在显著负相关。这一发现表明，ASFV感染可能通过某种机制抑制了干扰素的产生和信号传导。
4、巨噬细胞：通过比较对照和处理组间的差异表达基因，找到ASFV感染过程中免疫应答关键基因。
在感染巨噬细胞中共鉴定到21个表达下调的基因：进一步锁定排名前三的差异表达基因(ZFP36、MAFB、DUSP1），其中DUSP1 基因在感染后第3天显著增加，但在第5天和第7天急剧下降。
DUSP1基因在抗病毒反应中的作用：进一步的研究发现，DUSP1基因在ASFV感染过程中起着重要的抗病毒作用。使用DUSP1抑制剂（BCI）处理巨噬细胞，可抑制DUSP1的活性促进病毒的复制，表明DUSP1是ASFV感染的一个限制因子。
5、单核细胞：通过比较对照和处理组间的差异表达基因，找到ASFV感染过程中单核细胞中上调最显著的基因。进一步将单核细胞划分为3个主要亚群，研究ASFV感染期间不同单核细胞亚群的特征。
在ASFV感染后5天和7天，通过比较对照和处理组间的差异表达基因，找到ASFV感染过程中单核细胞中上调最显著的基因VAPB。先前的研究表明VAPB正向调控鼻病毒、诺如病毒和番茄花叶病毒的复制。
非洲猪瘟病毒可导致巨噬细胞大量死亡，并进一步转变为未成熟单核细胞亚群。将单核细胞进一步细分为三个主要亚群，重点关注ASFV感染期间不同单核细胞亚群的特征，发现不同的单核细胞亚群对ASFV感染的易感性不同。
6、揭示单核细胞中与MHC II类相关的基因及其在非洲猪瘟病毒感染期间的表达调控关系
在ASFV感染后第5天和第7天，多种主要组织相容性复合体（MHC）II类基因的表达水平下降，其中单核细胞最为显著。进一步确定了单核细胞中与MHC II类相关的基因，其中，CD74被确定为转录调节因子，可能与其他基因共同调控MHC II类和其他参与抗原呈递的基因的表达。
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结论
在本研究利用scRNA-seq，全面调查ASFV感染猪脾脏免疫细胞中疾病进展和病毒复制的分子相关性。确定了ASFV感染过程中细胞类型和状态丰度的变化，表征了脾脏中ASFV感染的细胞群，揭示了病毒调控宿主细胞的重要信号通路，为揭示ASFV感染路径和感染致病机制提供了关键数据。
参考文献
Zhu, Zixiang et al. “Single-cell profiling of African swine fever virus disease in the pig spleen reveals viral and host dynamics.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 121,10 (2024): e2312150121. doi:10.1073/pnas.2312150121
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