近年来，随着单细胞研究成本的显著下降，我们得以在单细胞相关课题中纳入更多样本量，从而提升研究的深度与广度。梳理当前发表的高水平单细胞研究文献，不难发现以下4种研究趋势正逐渐成为主流：
趋势1
增加生物学重复数量，提高数据的可靠性和代表性。
趋势2
设置多个比较组合，深入探究不同条件下的基因表达异质性。
趋势3
整合单细胞转录组+染色质开放性多组学数据，实现多维度调控机制解析。
趋势4
开展群体单细胞研究，揭示细胞类型特异性的遗传调控机制。
01.增加生物学重复数量
对于RNA-seq而言，设置生物学重复至关重要。早在2013年发表于Nature biotechnology的研究指出[1]，当生物学重复从2个变成 ≥ 3个时，差异表达基因的检出率显著提升。
图：当生物学重复从2个变成3个时，差异表达基因和转录本检出率显著提升
此外，增加生物学重复数量也可以有效降低变异系数，分析结果表现出更高的稳定性和一致性[2]。
图：针对不同表达水平的基因，增加生物学重复可有效降低变异系数
然而受限于高昂的研究成本，早期发表的很多非模式生物单细胞文章中仅设置了1-2个生物学重复。
近年来，随着单细胞测序成本的不断下降，很多文章也开始通过增加生物学重复数量的策略提升研究的可靠性，提升文章发表层次。
例如，2024年5月发表于Nature（IF 50.5）的人骨骼肌衰老调控机制研究中[3]，每组设置了10个以上生物学重复：其中成人组n=12，老年组n=19。基于多个生物学重复构建的人类骨骼肌衰老参考图谱，为相关研究提供了十分可靠的参考。
02.纳入更多品种、处理、时间节点
转录组测序主要探究基因表达的调控机制，这一过程在植物生长发育、非生物胁迫应答以及抗病机制研究中均扮演关键角色。目前，单细胞转录组测序按照本领域研究进程，可以大致划分为以下三个研究层次：
第一层次
构建某物种的单一组织细胞发育图谱。目前核心植物已基本完成，部分其他植物刚开始。
第二层次
构建某物种的多个组织细胞发育图谱。目前核心植物正在进行中，部分其他植物刚开始。
第三层次
针对植物生长、抗逆等重要性状开展不同品种、不同处理、不同时间节点样本的研究。目前核心植物正在进行中，部分其他植物未开始。
与第一层次研究相比，第二、三层次均需要纳入更多的样本进行研究。单细胞研究成本的下降极大地促进了其进展。
例如，2023年发表于Plant Communications（IF 9.3）的棉花根尖盐胁迫调控机制的单细胞研究中[4]，不仅针对不同处理时间设置了3个组别（0、0.5h、1h），也针对不同处理浓度设置了组别（0、100mM、150mM）。基于不同组别的多次比较分析，明确了根毛、表皮、根冠细胞表达的相关基因在盐胁迫响应中的关键作用。
03.开展单细胞转录组和染色质开放性的多组学研究
当前，多组学研究策略能为课题提供全方位、多层次的探索路径。基因的表达水平（无论是上调还是下调）受多重因素的综合调控，而染色质的开放性则是最直接的影响因素之一。在基因转录启动时，其上游的染色质会发生构象变化，开放并允许转录因子结合到DNA的特定序列上，与RNA聚合酶相互作用调节基因表达水平。
随着单细胞测序成本的下降，同时进行转录组（RNA）+染色质开放性（ATAC）的多维研究也逐渐成为高分文章的研究趋势。
例如，2024年发表于Advanced science（IF 14.3）的拟南芥根尖渗透胁迫调控机制的研究中[5]，研究者同时对于对照组和渗透胁迫组的拟南芥根尖进行了单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq，精准构建了渗透胁迫下调控拟南芥根尖细胞发育的特异性调控网络。
04.开展群体单细胞研究
表达数量性状基因座(Expression quantitative trait loci，eQTL)分析可识别基因型与性状的关联，其分析的核心在于明确变异（尤其是SNPs）与近端或远端基因表达量之间的关系。基于scRNA-seq进行eQTL分析，可明确具有细胞类型特异性的eQTL。
例如，2022年发表于Nature Neuroscience（IF 21.2）的研究中[6]，研究者针对192个样本的脑组织单细胞转录组测序数据进行eQTL分析，其中46%的eGenes表现细胞类型特异性。细胞类型水平的eQTLs影响更多的受限基因，并且比组织水平的eQTLs表现出更强效应。
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参考文献
[1] Hendrickson,David G,Sauvageau,et.al .Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq[J].[2024-11-04].
[2] Yuwen,Liu,Jie,et al.RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication?[J].Bioinformatics, 2013, 30(3).DOI:10.1093/bioinformatics/btt688.
[3] Yiwei Lai, Ignacio Ramírez-Pardo, et.al. Multimodal cell atlas of the ageing human skeletal muscle[J]. Nature. 2024 May;629(8010):154-164. doi: 10.1038/s41586-024-07348-6.
[4] Pengtao Li , Qiankun Liu, et.al. Transcriptional Landscape of Cotton Roots in Response to Salt Stress at Single-cell Resolution[J]. Plant Commun. 2023 Oct 27:100740. doi: 10.1016/j.xplc.2023.100740.
[5] Qing Liu , Wei Ma, et.al. Multiome in the Same Cell Reveals the Impact of Osmotic Stress on Arabidopsis Root Tip Development at Single-Cell Level[J]. Adv Sci (Weinh). 2024 Jun;11(24):e2308384. doi: 10.1002/advs.202308384.
[6] Julien Bryois , Daniela Calini, et.al. Cell-type-specific cis-eQTLs in eight human brain cell types identify novel risk genes for psychiatric and neurological disorders[J]. Nat Neurosci. 2022 Aug;25(8):1104-1112. doi: 10.1038/s41593-022-01128-z.
