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肝脏在猪整个出生后的生命周期中均执行了非常重要的代谢和免疫功能，然而，对于猪在出生后不同成长阶段中肝脏的动态发育过程，我们在细胞学层面上的了解相对有限。单细胞测序技术有助于以更高分辨率进行发育研究，为剖析细胞的功能异质性，定义细胞类型特异性转录因子以及揭示其基因表达的动态变化提供了重要技术支撑。但是，目前肝脏进行单细胞测序仍面临多重挑战：结构复杂，实质细胞内部有大量管状结构；肝脏代谢旺盛，离体细胞活力迅速下降；解离过程中细胞易碎释放酶加剧损伤；细胞类型多样，难以在单一解离条件下获得所有细胞类型等。所以，结合snRNA-seq和scRNA-seq有助于构建发育过程中全面的肝脏图谱。
文章题目：Single-cell dynamics of liver development in postnatal pigs
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发表时间：2023.11
发表期刊：Science bulletin
影响因子：18.9
研究对象：猪肝脏
研究方法：scRNA-seq, snRNA-seq和snATAC-seq
本研究以断奶前(30天)、断奶后(42天)、生长高峰(150天)和成年阶段(730天)四个生长发育重要阶段、不同性别、健康巴马香猪肝脏作为研究材料，综合使用scRNA-seq, snRNA-seq和scATAC-seq技术，深入研究了猪肝脏不同发育阶段代谢和免疫功能的动态变化。
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3.1. 整合scRNA-seq和snRNA-seq的猪肝脏的动态发育图谱
为了绘制发育中猪肝脏的细胞图谱，作者选取了四个发育阶段的肝脏样本（D30、D42、D150及D730）进行scRNA-seq和snRNA-seq，共捕获到84,824个细胞，鉴定到23种细胞类型。（图1a）。本研究发现，snRNA-seq在检测肝脏中肝细胞、胆管细胞和造血干细胞等大型、脆弱和罕见的细胞类型方面更具优势，scRNA-seq则擅长于识别组织内驻留的免疫细胞类型，因此，结合snRNA-seq和scRNA-seg有助于构建发育过程中全面的肝脏图谱。
在此基础上，作者进一步探索了肝脏发育过程中细胞组成的动态变化。研究揭示，随着猪日龄的增长，肝实质细胞（肝细胞与胆管细胞为主）的占比稳步上升，而间充质细胞（涵盖内皮细胞、周细胞及星状细胞）与免疫细胞的比例则呈现下降趋势（图1b）。这一发现与前人研究相吻合，再次印证了出生后肝脏发育过程中实质细胞逐渐占据核心地位的重要趋势。
此外，作者还发现了两种罕见的细胞类型。一种是肝脏内罕见的先天免疫细胞群——浆细胞样树突状细胞（pDCs）。另一种罕见的细胞类型是特化的肝内皮细胞（图1f-g）。
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图1 scRNA-seq和snRNA-seq鉴定猪肝脏发育中的细胞类型
3.2. 通过snRNA-seq和snATAC-seq技术，鉴定调控肝脏发育的细胞类型特异性转录因子（TFs）
利用snRNA-seq数据，评估了1839个TF编码基因的细胞类型特异性表达，并筛选出190个在肝脏主要细胞类型中具有高特异性的TFs（tau评分>0.85）(图2a）。在这些TFs中，作者确认了已知的关键调节因子如HNF4A、HNF1B、NR5A2等，并发现了多个未表征的TFs，如LSECs特异性的LUZP2，LUZP2在胚胎期LSECs中表达较低，而在成年期LSECs中表达显著增高，提示其在肝脏发育成熟过程中的潜在作用。
通过对D240肝脏进行snATAC-seq，作者在LSECs中观察到了LUZP2位点的开放染色质峰(图2d），进一步支持了其在该细胞类型中的活性。
多重免疫组织化学（mIHC）分析证实了LUZP2在成年猪肝LSECs中的高表达，而在其他细胞类型中表达较低或几乎不表达，为snRNA-seq结果提供了正交验证(图2c）。基因调控网络分析（使用pySCENIC）预测LUZP2可能调控Hippo信号通路相关基因，如CDH7、PLCB4和KIT，这些基因在细胞增殖和凋亡中起重要作用，暗示LUZP2可能参与调节肝脏大小和生长(图2e）。
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图2 肝脏发育的细胞类型特异性转录因子（TFs）
3.3. 肝细胞发育过程中的异质性
肝细胞在产后发育过程中承担着多样的代谢功能，这些功能随着时间的推移和细胞类型的异质性而不断变化。为了阐明肝细胞在出生后发育过程中的异质性，作者对从D30（即出生后30天）到D730（即出生后730天）的肝细胞进行了详细分析，确定了九个亚型，并观察到肝细胞亚型随着发育时间显著变化(图3a，b）。
为了了解出生后猪肝发育过程中肝细胞的转录组动力学，作者对D30、D42和D730的这些细胞进行了拟时序分析，并考虑了性别因素来重建肝细胞发育轨迹(图3c，d）。根据肝细胞的发育轨迹，作者进行了差异基因表达分析，鉴定出5693个基因的表达随时间的变化而显著变化，并将所选基因聚类为8个模块。发现，从早期发育阶段（D30）开始的肝细胞呈现出逐步成熟的趋势，这种成熟过程与多种代谢相关通路的富集密切相关，如尿素循环、酒精代谢和激素代谢等(图3e)。通过单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）分析，作者确定了与肝细胞发育和异质性相关的潜在转录因子（图3f）。
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图3 肝细胞发育过程中的异质性与转录调控作用
3.4. 肝窦内皮细胞的空间异质性及其沿肝小叶CV-PV轴的功能分区化
肝窦内皮细胞（ECs）在肝脏内展现出显著的空间异质性，特别是沿着肝小叶的中心静脉（CV）至门静脉（PV）轴，呈现出明显的功能分区。为了深入探究这一特性，本研究对由血小板内皮细胞粘附分子1（PECAM1）和降钙素受体样受体（CALCRL）标记的11,086个内皮细胞进行了细致的分类，最终识别出8个不同的亚型（图4a）。其中，LSEC亚群——APOE高表达LSEC（APOE+ LSEC），其APOE表达水平从D30逐渐增加至D730，提示该亚群在凝血调节中可能扮演重要角色。
LSECs作为肝脏内窦皮细胞的主要组成部分，展现了极高的转录多样性，尤其是在肝脏发育过程中。通过对比D30与D42、D42与D730之间LSECs的差异基因表达，作者发现D42时期的LSECs上调了与防御反应、免疫系统过程调控和白细胞活化相关的基因（图4c），表明这一时期的LSECs积极参与免疫应答。而D730时期的LSECs则上调了与脂质生物合成、血管通透性调节和N-乙酰神经氨酸代谢过程相关的基因（图4d），揭示了其在成人肝脏代谢中的关键作用。
进一步分析LSECs中24个重要受体基因的表达水平，作者发现MRC1, STAB2, STAB1, CLEC4G,FCGR2B是猪肝窦内皮细胞发育过程中主要的胞吞受体基因，这些基因在维持肝脏稳态和清除废物方面发挥重要作用。
间充质细胞在肝脏生理学和纤维化中起着重要作用，尤其是肝星状细胞（HSCs），它们在生理条件下储存维生素A，并调节血管循环。作者将来自所有四个时间点的间充质细胞重新聚类成七个亚型，以表征其在发育过程中的异质性（图4i）。基于scRNA-seq分析，作者确定了一个EBF1+成纤维细胞亚型，这些细胞在发育过程中显著增加。进一步分析表明，EBF1+成纤维细胞与血管生成和细胞外基质（ECM）重塑相关基因的表达上调相关。此外，作者还发现EBF1+成纤维细胞在肝脏损伤反应中可能发挥重要作用。通过mIHC检测证实了这种罕见细胞类型的存在(图4k)。
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图4 肝窦内皮细胞的空间异质性和间充质细胞多样性
3.5. 出生后肝脏发育过程中免疫细胞多样性的表征
肝脏内含有大量先天性和适应性免疫细胞，在宿主免疫反应中发挥基本作用。scRNA-seq数据呈现了多种免疫细胞群体，使作者能够描绘出出生后发育过程中免疫细胞的变化。为了深入探究发育中猪肝中NK细胞和T细胞的异质性，作者从scRNA-seq和snRNA-seq数据中筛选出38,167个T细胞和NK细胞，通过UMAP降维分析，最终鉴定出4种CD8+ T细胞亚型、1种CD4+ T细胞亚型、1种γδ T细胞亚型、1种CD4+ CD8+双阳性T细胞亚型和2种NK细胞亚型，共计9种免疫细胞亚型（图5b）。这些亚型涵盖了从出生后不同时间点的细胞样本，展示了免疫细胞在肝脏发育过程中的动态变化（图5c）。具体而言，作者发现了增殖性CD8+ T细胞，这类细胞在D30和D42时期最为丰富，并高表达一系列增殖相关基因（如图5d所示）。此外，还鉴定出CRTAM+ CD8+ T细胞，具有调节性T细胞的特征；GNLY+ CD8+ T细胞，展现出强烈的细胞毒性表型；以及CX3CR1+ CD8+ T细胞，被定义为效应型CD8+ T细胞，其特异性功能有待进一步探索。 在CD4+ T细胞方面，作者发现了Naïve/CM CD4+ T细胞亚型，这些细胞表达与记忆T细胞迁移相关的基因。同时，作者也观察到了γδ T细胞和双阳性CD4+ CD8+ T细胞的存在，它们分别在特定时间点高表达与自身发育相关的基因。对于NK细胞，作者鉴别出两种亚型：一种是常规NK细胞，特异性表达PDGFD；另一种是trNKs（组织驻留NK细胞），它们高表达EOMES、FCER1G等基因，显示出与人类trNKs相似的特征，并具备自我更新增殖能力（图5d）。跨物种比较显示，猪肝trNKs在转录因子表达模式上与人更为接近（图5e），这进一步证实了分类和注释的准确性。
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图5 出生后肝脏发育过程中的多样免疫细胞群体
本研究利用snRNA-seq和CellChat工具，分析了出生后肝脏发育中肝细胞与非实质细胞（NPCs）的通讯网络。发现肝细胞作为信号接收者时，通过WNT、HGF-MET和BMP信号通路与NPCs通讯，调控代谢、修复和铁稳态。作为信号发送者，肝细胞通过plg-par3和f2-par3参与凝血和纤溶调控。这些发现揭示了肝细胞与NPCs间复杂的通讯机制，对理解肝脏发育和疾病具有重要意义。
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图6 肝细胞和非实质细胞之间的相互作用
本研究利用scRNA-seq, snRNA-seq和scATAC-seq技术，深入研究了猪肝脏不同发育阶段代谢和免疫功能的动态变化。绘制了迄今为止所有哺乳动物中最新最全面的出生后肝脏单细胞发育图谱，鉴定并验证了稀有细胞类型；发现了肝实质细胞呈现高度的发育阶段异质性，揭示了与肝实质细胞发育或功能相关的阶段特异的转录因子编码基因；首次鉴定到LUZP2是成年猪肝窦内皮细胞特异的转录因子编码基因，提示其发挥阶段特异性功能；揭示了肝窦内皮细胞发育阶段特异性的功能变化，尤其是清道夫功能；发现了淋巴系免疫细胞(NK和T)出生后30天即主导肝脏免疫系统，其中肝脏组织驻留NK细胞(trNKs)表现出了与人类相似更保守的转录因子表达模式。该研究不仅对于提高家猪生产效率及饲料利用效率具有重要意义，同时，也为人类健康肝脏不同发育阶段的单细胞组成与功能提供了重要参考。
【参考文献】
Rao, Lin et al. “Single-cell dynamics of liver development in postnatal pigs.” Science bulletin vol. 68,21 (2023): 2583-2597. doi:10.1016/j.scib.2023.09.021
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