目前，单细胞转录组发育研究普遍涉及对多时间点数据的整合分析，基于多个发育节点数据推导出基因表达的连续轨迹。转录因子的激活是发育的关键因素，将转录因子的激活状态与细胞发育轨迹相结合，构建动态表达调控网络，有助于深入解析发育过程。
2024年9月，来自澳大利亚的研究团队在国际权威期刊Nature plants发表了题为Establishment of single-cell transcriptional states during seed germination的文章。该研究主要基于三个发育节点的单细胞转录组数据，构建了拟南芥胚的各细胞类型随发育进程的动态转录因子调控网络。
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文章亮点
基于3个发育节点的scRNA-seq数据，通过CSHMM-TF模型解析了拟南芥胚发育过程中，各细胞类型的基因表达轨迹和转录因子动态调控网络。
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实验设计
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文章思路
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主要结果
胚萌发的单细胞转录图谱构建
选取拟南芥种子萌发早期（12h）、中期（24h）和末期（48h）样本，每时期2个生物学重复，共计6个样本进行scRNA-seq。
收集种胚并制备原生质体。由于原生质体制备会影响应激相关基因表达，通过相应节点样本的Bulk RNA-seq 进行校正，去除原生质体制备引发的应激基因表达的干扰。
由于种子萌发早期基因表达水平低，不易进行双胞液滴识别。为了有效过滤双胞细胞，在萌发早期进行Col-0、Cvi-0原生质体1:1混合测序。通过出现2个生态型混合的SNPs识别真实双胞液滴。后续使用来自Col-0的细胞进行分析。
总计捕获来自于Col-0的细胞数12,798个，每个细胞平均表达1,025个基因。注释了15个cluster中的13种细胞类型（叶肉、下胚轴、表皮、胚根、胚根顶端分生组织、静止中心/小柱细胞）并通过RNA原位杂交验证注释结果。
下胚轴皮层细胞发育的动态变化
涉及到下胚轴皮层细胞（cluster1、5、7）的三个cluster在每个时间节点的占比不同，表明下胚轴皮层细胞存在异质性。但由于差异微小，无法对三个cluster做进一步区分。
AT4G16410是cluster1、5、7在12h、24h节点的特异性高表达基因。通过RNA原位杂交验证其在下胚轴下部和中部皮层细胞中表达。
对下胚轴细胞（cluster1、2、5、6、7、10）进行再次聚类。cluster1、5、7由于表达高度相似仍被注释为下胚轴皮层细胞，表明cluster1、5、7代表在萌发过程中不同转录状态的下胚轴皮层细胞。
基于下胚轴皮层细胞（cluster1、5、7）进行拟时序分析并构建其发育轨迹。三种cluster在拟时间轨迹上的排列也遵循真实的萌发过程。
由于下胚轴皮层细胞的功能在萌发过程中发生了变化，基于共表达基因分析（Louvain community analysis）获得25个共表达模块，并评估模块功能和表达时间的关联。
在萌发早期，共表达模块与染色质可及性、转录、RNA剪接和翻译相关；萌发中期，与翻译、蛋白质成熟和光合作用相关；在萌发晚期，与光合作用相关。综上表明，基因动态表达驱动了萌发过程中下胚轴皮层细胞的功能变化。
初始转录细胞的动态转录变化
萌发早期（12h）主要由cluster 8和cluster 11 相关细胞主导。相关性分析表明，cluster 8 与1h、6h的Bulk RNA-seq相似性最高，表明cluster 8 和cluster 11具有不同生物特性。
通过RNA原位杂交验证了cluster 8、11的表达部位。cluster 8的2个marker基因（AT4G25140和AT5G35660）在1h、6h、12h的整个胚中均有表达。
相比之下，cluster 11的2个marker基因仅在原维管细胞中表达。此表达区域对应于脱落酸和赤霉酸信号传导，与调节休眠种子的萌发决策相关。表明cluster 8 代表了大多数胚细胞在萌发早期的转录状态；cluster 11 可能代表了已经做出萌发决策的细胞。
基于CSHMM-TF预测不同细胞类型的基因表达调控程序
通过连续状态隐马尔可夫模型-转录因子（CSHMM-TF）预测不同细胞类型的动态基因调控程序。萌发中的基因表达是一个复杂的动态过程，每个cluster在萌发过程中都表现出不同的基因表达模式，富集的基因功能注释也随萌发而变化。
例如，与初始转录细胞相关的cluster 8 、11的拟时间顺序与实际萌发时间一致，两个cluster在萌发中表现独特的基因表达模式，表明每个cluster的基因调控程序不同。
进一步基于cluster 8 、11中特异性转录因子验证了本模型的实用性。在拟南芥中敲除/敲降相关转录因子表达，结果表明突变体的萌发率表现不同程度的增加，Bulk RNA-seq也表明靶基因表达出现不同程度变化。然而，由于不同细胞类型中存在特异性表达的转录因子，使用Bulk RNA-seq验证靶基因表达可能缺乏敏感性。
进一步分析所有cluster的表达调控程序，总共预测81个活跃的转录因子，其中39个是特定cluster中特异性表达的。敲除/敲降这些转录因子基因，突变体的种子发育、萌发和早期幼苗生长相关的表型均发生变化。
综上，种子萌发过程中胚的各细胞类型具有独特的基因调控程序，并由特定转录因子调控。本预测模型可识别这些转录因子，并进一步应用于其他研究。
格致博雅目前在植物单细胞转录组测序中已积累了丰富的项目经验。欢迎有植物单细胞意向的老师在公众号后台留言或联系当地销售。
