发育生物学的核心问题是多细胞生物体如何从单细胞受精卵发育而来。机体发育的每个时期都存在细胞分化事件。探索发育过程中的细胞种类和不同细胞的分化轨迹是发育生物学研究的重要目标。
单细胞转录组测序在发育生物学领域发挥重要价值。处于相同发育时期的细胞也可能具有基因表达异质性，单细胞转录组测序可以从单细胞分辨率解析不同细胞的表达谱。
基于每个细胞表达谱的相近程度构建变化轨迹，可以模拟细胞动态发育过程，推导细胞可能的分化/演化轨迹，上述过程即为拟时序分析（pseudotime analysis）。拟时序分析可探究细胞变化的驱动基因。
拟时序分析常见挖掘思路
选择感兴趣的细胞亚群进行拟时序分析，明确发育轨迹。
对关键基因进行免疫染色等验证，明确细胞类群转化，验证发育方向。
对轨迹上具有相似表达趋势的基因进行分组，通过GO、KEGG富集分析，明确不同功能基因表达随时间的变化模式。
拟时序轨迹中的分支点代表细胞开始产生程序性变化，对分支相关的差异基因进行表达聚类和功能富集，明确调控不同发育方向的关键基因。
题目名称：Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of myogenic diferentiation in pig
发表期刊：Research Article（IF：11.036）
为了全面了解猪骨骼肌发育过程，使用scRNA-seq技术对藏猪（ZZ）和杜洛克×藏猪（DZ）的胚胎期（E16、E18、E21和E28）体节和肌节组织进行评估，共8个样本，鉴定到12种细胞类型。
不同发育阶段的各类细胞占比差异显著，低分化细胞（如上皮细胞、内皮细胞和神经干细胞）的比例随着发育而减少，而高度分化的细胞（如成纤维细胞、成骨细胞和肌细胞）的比例则随着发育逐渐增加，表明在E16至E28期间体节发育迅速。
细胞分群与注释及细胞占比情况
为了进一步剖析发育中肌源性细胞的异质性，将progenitors/myoblasts、myocytes和muscle cells进一步细分为8个亚群，并被注释为Pax3+祖细胞、成肌祖细胞、成肌细胞、肌细胞、心肌细胞和其他细胞。
肌源性细胞亚群分群与注释
基于实际情况对细胞分化轨迹进行优化
为了重建肌源性细胞分化轨迹，选取肌源性细胞中的相关的4个细胞亚群（Pax3+祖细胞、成肌祖细胞、成肌细胞、肌细胞）进行拟时序分析，展示了从祖细胞到成熟肌细胞的复杂分化过程。然而，第一个小分支state 2和分支末端state 7均属于肌细胞。
肌源性细胞拟时序轨迹分析
不同之处在于，stage2的肌细胞表达了心肌细胞特异性标记物MYL9，显著差异表达基因主要与心脏发育相关；而stage7中的肌细胞表达了骨骼肌细胞特异性标记物MYOD1、MYOG，显著差异表达基因主要与骨骼肌发育相关。故stage2为心肌细胞，在后续分析中将其排除。
肌源性细胞分化轨迹中state2分支的去除
细胞比例变化预测
肌源性细胞在所有发育阶段的总比例并未发生明显变化，故进一步探究肌源性细胞的4种细胞亚群在不同发育阶段的比例变化。
其中，Pax3+祖细胞随发育进展比例降低，成肌祖细胞、成肌细胞、肌细胞比例显著增加。通过对骨骼肌特异性标志物免疫荧光染色表明：骨骼肌细胞在E21时出现，并在E28时显著增加，表明该时期为骨骼肌谱系建立关键期。
细胞比例变化预测
基因转录动态变化
骨骼肌发育过程中各类基因的变化趋势
基于拟时序轨迹上前1700个差异表达基因进行表达模式聚类，明确猪骨骼肌发育过程中各类基因的表达动态变化。
成肌分化过程中的转录组动态变化
题目名称：Single-cell transcriptomic atlas of goat ovarian aging
发表期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology（IF：6.22）
采集大足黑山羊三个年龄段的卵巢样本（D1、Y2、Y10）进行单细胞转录组测序，鉴定了山羊卵巢中的九种细胞类型。
细胞分群与注释
基于CytoTRACE分析表明颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、上皮细胞，具有较高的分化程度，而生殖细胞、免疫细胞和平滑肌细胞则显示出较低的分化潜力。
CytoTRACE分析
GCs（颗粒细胞）在决定卵巢功能中起着关键作用，故针对颗粒细胞进行拟时序分析。拟时序轨迹显示了两个分支点，结果表明GCs从原始卵泡到腔前卵泡的发育是不均匀的。此外在老年卵巢中，大多数GCs处于state 1，表明GCs的分化潜能在衰老过程中逐渐丧失。此外，通过RNA速率分析进一步验证GCs中的发育轨迹。
不同发育阶段GCs拟时序分析
细胞周期评分表明：在老年卵巢的颗粒细胞中，G1期细胞的比例明显较高，证实了大量颗粒细胞发生了细胞周期G1期阻滞，导致不可逆的细胞增殖阻滞，这一结果也与上述拟时序分析结果相验证。
不同发育阶段GCs的细胞周期状态
基于拟时序轨迹的特征基因和高可变的基因进行表达模式聚类，明确山羊卵巢发育和衰老过程中GCs相关基因表达的动态变化。
拟时序差异表达基因聚类热图
对不同年龄GCs关键基因表达变化进一步探究，结果表明：在新生山羊卵巢中，与类固醇激素反应相关的基因表达和与卵巢储备相关的基因表达逐渐增加；卵泡发育相关的重要基因在老年山羊卵巢中持续下调。进一步通过免疫荧光验证老年山羊的卵巢储备减少。
不同年龄GCs关键基因表达变化趋势
免疫荧光染色
题目名称：Single-cell transcriptomes and runx2b-/- mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish
发表期刊：National Science Review（IF：20.6）
取 60dpf 野生型斑马鱼的尾部肌肉组织，进行单细胞转录组测序， 获得18种细胞类型。
细胞分群与注释
挑选与肌间刺形成相关的细胞群进行拟时序分析
为了探究成骨细胞的起源，选取肌腱祖细胞、成熟肌腱细胞、分化肌腱细胞、成骨细胞进行了拟时序分析。发现4类细胞分别排列在拟时序轨迹的的不同位置：肌腱祖细胞位于分化起点，分化中肌腱细胞位于中间，而成骨细胞和成熟肌腱细胞分别位于2个分化末端。
与肌间刺形成相关的细胞群的拟时序分析
拟时序分支节点动态变化的基因集
以肌腱祖细胞为起始点，获得细胞向两个方向分化时的基因动态变化热图，包含3个具有不同表达变化趋势的模块基因，其中7个基因（ runx2a, runx2b, bmp2a, scpp1, spp1, entpd5a, entpd5b ）在成骨细胞中表达显著上调，3个基因（sost, sox11b, ccn4b）在肌腱祖细胞中高表达，而在成骨细胞和成熟肌腱细胞中表达较低。
肌间刺形成相关的细胞群的转录动态变化
基因敲除实验表明，entpd5a-/-(40dpf)和runx2b-/-无肌间刺，然而entpd5a-/-在40dpf时死亡，runx2b-/-突变体正常存活，且游泳性能、生长和骨密度与runx2b+/+斑马鱼没有显著差异，表明runx2b在鱼间刺形成中起关键作用。
基因功能验证
[1] Cai, Shufang et al. “Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of myogenic differentiation in pig.”BMC biology vol. 21,1 19. 1 Feb. 2023, doi:10.1186/s12915-023-01519-z
[2] Xu, Dejun et al. “Single-cell transcriptomic atlas of goat ovarian aging.”Journal of animal science and biotechnology vol. 14,1 151. 6 Dec. 2023, doi:10.1186/s40104-023-00948-8
[3] Nie, Chun-Hong et al. “Single-cell transcriptomes and runx2b-/- mutants reveal the genetic signatures of intermuscular bone formation in zebrafish.” National science review vol. 9,11 nwac152. 2 Aug. 2022, doi:10.1093/nsr/nwac152
