院士团队50分+巨作：转移性肿瘤研究攻略

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众所周知，肝胆、结直肠等腹部肿瘤，尤其是转移性肿瘤的研究，已经非常非常卷了！但是，大牛总是有自己独特的视角！2024年1月，樊嘉院士团队在Cancer Cell IF=50.3，发表题为“整合多组学分析解剖转移性肝细胞癌的时空演化Integrated multi-omics profiling to dissect the spatiotemporal evolution of metastatic hepatocellular carcinoma”文章。

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这篇樊嘉院士团队新发表的文章，将转移性肿瘤的分析进一步细化，侧重分析比较不同异质性的肝肿瘤原发灶（包括多原发、单原发）各自的肝内、肝外转移相关基因组特征、克隆进化机制、转移的时向特点；并根据显著差异的基因组特征进一步分亚组，基于单细胞转录组数据，进一步解析差异的免疫特征、分子机制；最终鉴定出可以同时抑制HCC不同类型的转移的靶向药物。

研究团队收集了来自手术切除的HCC患者的肿瘤组织样本，并进行了全外显子组测序（WES）、RNA组测序（RNA-seq）和T细胞受体（TCR）测序。进一步分离了肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和原代肿瘤细胞（PDOs）进行体外和体内实验。通过整合多组学数据来解析转移性肝细胞癌（HCC）的时空演化过程。揭示了HCC的时空演化过程，并探索了与转移相关的分子机制，为临床治疗提供新的思路和靶点。

一、背景

肝癌是全球癌症死亡的第三大原因，肝细胞癌（HCC）占大多数病例。多达60%的局限性可切除疾病患者在诊断后5年仍存活，相比之下，远处转移患者仅为4%。由于转移在很大程度上仍无法治愈，因此了解这一过程对于改善晚期HCC患者的预后非常重要。几项大规模测序工作为驱动HCC发病机制的关键遗传和转录过程提供了有价值的见解。,然而，大多数分析是针对原发性肝细胞癌进行的，很少有测序转移。

尽管转移瘤与原发瘤具有共同的关键驱动基因改变或转录程序，但它们在播散和治疗过程中往往会发展出新的性状。随着高度异质性原发病灶和可能更均匀的转移的发展，迫切需要通过对匹配的原发性和转移性肿瘤进行测序获得的转移性疾病的综合遗传和分子景观，以阐明生物学基础并确定更有效的HCC转移治疗策略。

二、结果

1、成对原发性和转移性肝细胞的基因组图谱

肝外转移组（MET组，n=335个区域）包括78例患者的成对原发肿瘤（PTs）、肝内复发性肿瘤（RTs）和肝外转移性肿瘤（MTs），无复发/转移组（NRM组）包括31例术后无复发或转移的患者（≥6年）。

内部验证队列包括65例具有不同临床结果的未配对PT患者，外部验证队列包括来自天津医科大学肿瘤研究所和医院的8例PT和MT配对患者（图1A；S1A）。

使用全外显子组测序（WES）和/或RNA测序（RNA-seq）对所有区域进行分析。其中，MET组52.3%的PTs和MTs为多区域测序（图S1B）。MET组的转移具有广泛的时空表征，包括原发性HCC手术后0-67个月出现的9个不同的转移部位（图1B，1C和S1B）。

使用Mutect2对所有肿瘤区域进行单核苷酸变异和小插入缺失（Indels）检出。独立的Sanger测序证实了>95%的代表性突变检出来自WES（图S1D）（图S1E）。

根据癌细胞分数以及它们在多采样区域中的存在来区分克隆或亚克隆突变。MutSigCV鉴定训练队列中所有PT的8个常见突变基因，并分析与TCGA数据PT中HCC驱动基因的突变率相似性（图S1F）。

专注于克隆突变，以鉴定MT中反复突变的基因，三个抑癌基因被鉴定为MTs中显着复发的突变：TP53（32/72），RB1（11/72）和PTEN（7/72）；,使用Sequenza和Gistic推断体细胞拷贝数改变（SCNA），在PT和MT中观察到的广泛和局灶性复发性SCNA模式（图1D)。

综上所述，该研究观察到的MT中高度频繁突变和SCNA的特征和先前研究中的PT高度一致。

图1

图S1

2、追踪肝癌转移的克隆起源

为了追踪MT的克隆起源，使用Treeomics重建了同一患者体内所有测序肿瘤的系统发育和PTI；重点关注三种：多灶性PT、RT和MTs以及多发性MT患者。

大约41%-75%的HCC病例在临床上被诊断为多灶性PT，30%的多灶性PT是多中心（即遗传上不同的起源）。在作者的队列中，在6例多灶性PT患者中有2例观察到多中心PT（图S2A）。表明MT更有可能由一个多中心HCC谱系播种。

在肝细胞癌中，放疗可分为遗传相似的肝内转移（IM）和遗传上不同的多中心发生（MO）。然而，IM-RT和MO-RT谱系或只有一个谱系是否可以作为转移源仍然未知（图S2C）。

将所有16个RT分为IM-RT（n=11）和MO-RT（n=5）。没有一个MTs来自MO-RTs（图S2C）。相比之下，在IM-RTs患者（n=7）中，71%的MT由IM-RTs而不是PTs接种（图S2D）。在患者M021中，连续发生了三次独立复发（图2B）。前两次复发（RT1和RT2）被指定为IM-RT，而第三次复发（RT3）被指定为MO-RT。进化轨迹分析表明，骨转移起源于IM-RT谱系（RT1/RT2），而非MO-RT谱系（RT3）。同样，患者M048中遗传不同的MO-RT没有种子转移（图2C）。这些结果表明，MO-RT谱系的转移能力弱于IM-RT谱系，与MO-RT的较好预后一致。

MTs也可能播种新的远处病变，系统发育分析表明后续的MTs倾向于由PT播种，而不是早期的MTs。然而，一些病例表明，转移细胞不仅播散到不同的器官，而且还在原始器官中自行播种（图2C-2D）。

总之，结果表明肝外转移是以单谱系方式播种的，来自该谱系的任何阶段的肿瘤（PT、IM-RT或MT）都可能是潜在的来源（图2E）。

图2

图S2

3、HCC转移性播散模式的特征

癌症转移可以通过单个亚克隆（单克隆播种）或多个不同的亚克隆（多克隆播种）播种。在这项研究中，在39例多区域采样MT（n=43个肿瘤）和配对PTs/RT的患者中，10/43个MT（23%）由来自PTs/RT的多个不同亚克隆接种（图3A）。转移性播种模式与MT大小或全身治疗无相关性（图S3A）。

分析单克隆和多克隆播种是否与不同的临床疾病进展率相关。33例患者术后出现异时性转移，进一步分为两亚组：快速进展（多部位疾病进展<12个月手术）或减弱进展（单部位进展<12个月或多部位进展>12个月）。多克隆接种患者进展迅速，而单克隆接种与进展减弱相关（图3B）。

生存分析表明，转移性播种模式是总生存期的重要预后因素（图3C和S3B）。

发展多克隆MTs的PT的基因组和转录组学特征。GSEA突出了多克隆接种PT中缺氧信号转导的转录激活（图3D和S3C），并通过了IHC染色验证（图3E，3F和S3D）。

为了验证缺氧信号增强与多克隆之间的假定因果关系，进行体内细胞混合实验（图3G和S3E）。随后对肺转移的分析表明，HIF1A-KD细胞在多色病变的发展中表现出统计学上的显着减少，HIF1A-OE细胞的多色转移显着增加（图3H和3I）。

综上所述，多克隆接种与较差的预后相关，并且缺氧程序可能有助于HCC的多克隆播散。

图3

图S3

4、PT和MT之间的基因组差异提示早期转移播散

近期的研究训练转移性播散可能在多种癌症类型的早期开始，但肝细胞癌转移播散的时间尚不清楚。

克隆突变分为PT-private、MT-private和sharedmutations；PT-private突变计数显著高于共享突变和MT-private突变计数（图4A；A）。

为了模拟转移性播散的时间顺序，作者开发了一个基于配对PT和MT之间基因组异质性程度的模型（图4B)。

转移性前体的早期出现被定义为0<R∗≤0.5，晚期传播为0.5<R∗<1.0（图4C）。在训练和外部验证队列中，大多数MT早期从PT传播（图4D）。SCIMIT系列还预测早期转移占病例的>80%（图S4B）。

在训练队列中，还观察到肝内转移的早期播散占主导地位（图S4C）；此外，早期出现的MTs表现出明显的亚克隆突变，这也支持了它们的早期转移接种（图4E）。

进一步探讨了传播时机与临床参数之间的关联。遗传定义的晚期播散在经腔转移中更常见（图4F）。转移的时间与同步转移或PT的大小无关（图S4D）。

鉴于PT和MT之间的高度遗传差异，进一步研究它们是否具有共同的可成药靶点。将所有传递的变异映射到临床注释数据库（CIViC、DGIdb的，和药物银行）和HCC相关成药基因。与共享突变相比，在MT-private和PT-private突变中观察到更多的潜在药物靶点（图4G)。

综上所述，这些结果表明，在转移性克隆早期播散后，PT私有和MT-私有的亚克隆突变继续积累，导致PT和MT之间的遗传谱存在差异。

图4

图S4

5、转移内异质性阐明了免疫逃逸的进化

由于进化瓶颈，MT被认为比PT更同质；MSK-MET研究表明，大多数癌症在MT中更均匀（图5A）。然而，在包括HCC在内的少数癌症中，MT与PT一样具有异质性（图5A和5B）。

与MSK-MET研究一致，训练队列中的MT表现出与配对PT相似水平的亚克隆突变（图5C；S5A）。表明HCCMT中存在高基因组肿瘤内异质性（ITH）。

肿瘤特异性突变以新抗原的形式介导肿瘤免疫原性，新抗原ITH是PT免疫监视的高度相关决定因素，在转移性疾病中，ITH对新抗原景观和对抗肿瘤免疫敏感性的影响仍未得到探索。

为了表征转移性HCC中的新抗原异质性，分析了34对MT进行了配对的多区域DNA和RNA测序的患者，总共预测了13,308个潜在的新抗原（图S5B）。

为了研究新抗原ITH在MT中的临床相关性，将MT区域分为两组，具有不同的新抗原ITH阈值，通过亚克隆新抗原分数进行估计，以避免测序深度偏差（图5D）。发现具有高新抗原ITH的MT，与总生存期显着缩短相关（图5E和S5C）。

新抗原ITH高的MT区域具有显着较低的克隆性新抗原负荷和较高的亚克隆性新抗原负荷，而组间新抗原总负荷没有差异（图5F和S5E）。

分析新抗原ITH高和低MT之间肿瘤微环境（TME）免疫组成的差异。高新抗原异质性的区域表现出CD3，CD4，CD8和GranB细胞的浸润显着减少，并且CD45RO细胞趋于较少（图5G和S5H）。

TCR组库测序显示，在新抗原ITH高的区域，T细胞克隆率显着降低；这意味着T细胞的克隆扩增有限（图5H；S5I）。

这些分析表明高新抗原异质性与转移中抗肿瘤T细胞免疫功能失调相关，这可能归因于新抗原耗竭或抗原加工和呈递机制（APM）的破坏。为了区分这两种可能性，作者逐个区域绘制了它们的发生区域（图5I）。

首先应用观察到/预期的新抗原比率来量化每个转移区域的DNA免疫编辑程度，发现新抗原ITH高和低MTs的免疫编辑评分无显著差异（图5J）。与低新抗原ITHMT相比，在高新抗原ITHMT中更频繁地观察到抗原呈递中断——通过人类白细胞抗原杂合性缺失（HLA-LOH）和体细胞突变或编码APM成分的基因中的拷贝数丢失事件（图5K）。

接下来评估呈递机制（APM）破坏是从接种肿瘤细胞中遗传的还是在定植后获得的。发现绝大多数APM缺陷在MT配对的PT中不存在，表明癌细胞在转移接种后进化了这些事件（图5L；5M）。与没有亚克隆APM缺陷事件的配对区域相比，具有亚克隆APM缺陷事件的区域对HLA-A蛋白的染色明显减少（图5N）。

综上所述，MTs在HCC中表现出更高水平的转移性异质性。高新抗原ITHMT在转移定植后随着新抗原呈递功能障碍而进化，这可能会损害抗肿瘤T细胞免疫并导致不良临床结局。

图5

图S5

6、HCC转移期间选定的SCNA

通过加权基因组不稳定性指数（wGII）衡量，MTs比PTs具有更高的SCNA负担（图6A）。然而，PT和MT之间的肿瘤突变负荷（TMB）没有显着差异（图S6A）。此外，肝外转移的PT显示出显著升高的wGII（图6B），而TMB在组间相似（图S6B）。

为了鉴定可能促进转移的潜在的大规模基因组改变，比较了每个事件在“选定”克隆和“未选定”克隆中发现每个SCNA的次数比例（图6C），发现3个局灶性SCNA缺失和4个臂水平缺失在选定的克隆中显著富集（图6D和6E）。

鉴于癌症转移过程中的多任务过程，任何一个选定的SCNA都可能不足以完成整个任务。因此，进一步通过将每个转移中选定的SCNA数量相加来生成转移富集SCNA（MetSCNA）的评分；与配对的PT相比，MTs显示出显着更高的MetSCNA分数（图6F）。具有转移结局的PT的评分显着高于NRM组的PT。

具有较高MetSCNA评分的患者显示出显着更短的转移时间（异时性）、更差的无进展生存期（图S6D；图6G-6H）。多变量分析显示，快速转移进展与MetSCNA评分之间的强相关（图S6E）。

为了在功能上验证三个局灶性缺失的促转移作用，提取了142个位于这些片段中的基因。如果基因满足以下标准，则保留基因进行进一步分析：（a）与没有缺失的样本相比，在含有缺失的样本中显着下调，（b）与PT相比，在MT中下调，以及（c）与临床结果的显着关联。

最终保留三个基因（CHID1、RNH1和PNPLA2）用于功能验证测定（图6I和S6G）。构建稳定抑制这三个基因表达的人HCC细胞系，并鉴定其体内转移潜力，发现敲低CHID1和RNH1显着增加转移发生率和负担（图6J、6K、S6H和S6I）。

综上，研究团队鉴定了可能导致HCC转移进展的全球wGII和7个候选SCNA，支持了赋予癌细胞转移潜力需要宏观进化飞跃的假设。

图6

图S6

7、在转移进展过程中未选择亚克隆Wnt相关突变

进一步表征转移进展过程中驱动突变的进化选择，发现除了TP53和CPS1之外，HCC特异性驱动因素上的大多数亚克隆突变都没有被选择（图7A），泛癌驱动因素也表现出类似的“未选择”模式（图S7A）。

在13个“未选择”的亚克隆驱动突变中，有4个基因（CTNNB1、AXIN1、APC和NCOR1）参与致癌Wnt通路。IHC进一步证实了“未转移”亚克隆中Wnt信号转导的激活（图7B）。

特别是，转移过程中未选择Wnt相关突变仅适用于亚克隆突变，不适用于克隆突变。

这些结果表明，在进展到转移期间，亚克隆Wnt突变的进化动力学模式是“未选择的”。

图7

8、来自MT配对PT的Wnt野生型区域含有富含癌症相关成纤维细胞的反应性TME，有利于转移性播散

继续研究在具有或不具有Wnt相关突变的亚克隆之间观察到的明显选择性转移优势的机制。

MET组的所有PT区域均分为两个亚型。具有四个频繁突变的Wnt相关基因之一的区域定为Wnt突变（Wnt-mut），而没有上述突变的区域定为Wnt野生型（Wnt-wt）（图7C）。单样本GSEA和IHC证实Wnt-mut区域的特征是Wnt下游基因的表达显着升高（图S7C）和GS染色（图S7D），意味着激活的Wnt信号转导。

差异表达分析鉴定Wnt-mut和Wnt-wt区域之间显着上调/下调基因；GO和GSEA显示Wnt-mut区Wntβ-catenin信号、代谢的强烈富集，而Wnt-wt区富集于免疫应答、CAF激活、上皮-间充质转化（EMT）和血管生成（图7D和S7E）。

介导TME相互作用的细胞因子在Wnt-wt区域显著上调（图S7F）。为了阐明Wnt-wt肿瘤细胞中细胞因子表达升高的机制，分析了TCGA-LIHCATAC-seq数据，发现NF-κB-p65基序在Wnt-wt特异性染色质峰中排名第二（图S7G）。

使用代表Wnt-wt（MHCC97H细胞）和Wnt-mut（MHCC97H细胞上的AXIN1敲除）的细胞系模型进行了转录组分析和ATAC-seq测定。

发现NF-κB通路下游的基因在Wnt-wt细胞中显示上调（图S7H）。NF-κB基序在Wnt-wt细胞特异性的开放染色质区域中明显富集（图S7I和S7J）；在Wnt-wt细胞中的NF-κB转录活性高于Wnt-mut细胞（图S7K）；Wnt-wt区域的免疫细胞和基质细胞浸润更大（图S7L）。

综上，Wnt-mut和Wnt-wt区域之间高度不同的基因表达谱表明其肿瘤生态系统存在根本差异。

为了剖析肿瘤生态系统的细胞组成，应用15个标记的IHCpanel，然后进行数字病理学分析。Wnt-wt区域具有较高的TME细胞性（图7E和S7M），并且其特征在于对CAF激活标志物（图7E和S7N）、更大效应CD8+T细胞染色、免疫抑制信号和抑制性免疫细胞类型（调节性T、髓源抑制细胞）（图7E）。

为了破译细胞和表达程序在多细胞群落中的空间组织方式，使用NanostringGeoMx人类全转录组图谱对同一肿瘤内共发生的Wnt-mut和Wnt-wt区域进行了数字空间分析（DSP）（图7F）。

DSP数据的反卷积显示细胞毒性评分没有差异，但CD8中终末衰竭T细胞评分显着升高（图7G和S7P）。来自Wnt-wt区域的CAFAOI表现出肌成纤维细胞CAF降低，但炎症CAF特征增加（图7G）。

综上所述，Wnt-mut和Wnt-wt区域代表了不同的区域免疫和基质环境。Wnt-mutTME含有较少的免疫细胞和基质细胞；Wnt-wt区域的特征是富含CAF、衰竭T细胞和免疫抑制的TME。

进一步分析恶性细胞和各种TME细胞之间的相互作用，发现CAF和恶性细胞显示出最强的细胞相互作用（图7I）。

进行癌细胞系-CAF和患者来源的类器官（PDO）-CAF共培养测定（图S7R）。选择具有高转移潜力且无Wnt相关突变的HCC细胞系MHCC97H作为Wnt-wt恶性细胞模型。构建了AXIN1敲除（KO）MHCC97H细胞系以模拟Wnt-mut细胞（图S7S和S7T）。

建立了PDO模型，并从5个具有遗传确认的Wnt突变状态的HCC标本中提取了CAF（图S7U）。发现MHCC97H-wt细胞表现出显着更高的CAF募集能力（图7J和S7V）；成纤维细胞活化的关键介质在MHCC97H-WT细胞中的表达显着更高（图7K）。Wnt-wtPDO募集的CAF明显多于Wnt-mutPDO（图7L和S7V）。

总之，Wnt-wtHCC区域似乎含有富含活化成纤维细胞的反应性TME，通过激活EMT程序赋予Wnt-wt癌细胞更强的转移播散能力（图S7W）。

图S7

9、Wnt-wt mt免疫抑制B细胞富集并通过CD94-NKG2A轴介导CD8+ T耗竭

对转移性HCC标本进行单细胞测序（图8A，S8B和S8C），鉴定了几种T细胞、自然杀伤细胞、B/浆细胞和多个骨髓亚群（图S8D-S8G）；见一步分析CD8+T细胞分化轨迹，并在Wnt-mut和Wnt-wtMT组间比较（图8B-8C；S8H）。

结果发现，T细胞分化轨迹很大程度上取决于其Wnt状态，来源于Wnt-mutMT的CD8+T细胞主要位于轨迹的中央段（图8C和S8G）。相反来自Wnt-wtMT的CD8+T细胞严重偏向轨迹末端，其特征是终末耗尽的T细胞（图8C和S8G）。

此外，Wnt-wtMT中B浸润的倾向明显（图8B和S8J）；scRNA-seq数据的无监督聚类显示五个不同的B细胞簇（图S8E）；值得注意的是，记忆B细胞表达更高的B细胞相关分子，表明免疫抑制表型（图8F）。

随后，CellChat推断了记忆B细胞和所有免疫细胞之间假定的配体-受体相互作用，发现记忆B细胞与CD8Term的相互作用权重最高（图8G）。

进一步的表征显示，在Wnt-wtMTs的背景下，HLA-E:CD94-NKG2A是记忆B细胞和CD8Term之间最显著的配体-受体对（图8H）。

结果表明免疫抑制性B细胞可能通过诱导CD8的终末衰竭来损害抗肿瘤免疫力+Wnt-wtMT中的T细胞。为了验证这个结论，进行CD8+ILs和HLA-E+或HLA-E-肿瘤浸润B细胞(TIBs)的共培养实验，发现HLA-E+TIBs显著降低CD8+TIBs的脱颗粒能力，并诱导了CD8+TILs的耗竭(图8O；S8K)。

此外，与HLA-E+B细胞共培养时，NKG2A阻断(monalizumab)有效地恢复了CD8+TILs的细胞毒性能力，并显著降低了最终耗尽的CD8+TILs的比例(图8P和S8L)。

综上所述，Wnt-wtmt表现出免疫抑制B细胞的浸润增加，通过HLA-E:CD94-NKG2A相互作用导致CD8+TILs的耗竭。靶向这种相互作用的策略，具有转移性HCC治疗的潜力。

图8

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