导读
肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质。肿瘤和周围环境密切相关，不断进行交互作用，肿瘤可以通过释放细胞信号分子影响其微环境，促进肿瘤的血管生成和诱导免疫耐受，而微环境中的免疫细胞可影响癌细胞增长和发育。免疫微环境的异质性是肿瘤耐药、复发和预后差的重要原因之一。近年来，化疗、免疫治疗及联合治疗的方案给晚期肿瘤患者带来了希望。其中，探究肿瘤免疫微环境的异质性对于治疗选择、疗效预测、联合方案和开发新的免疫治疗靶点等有重要指导作用。
肿瘤免疫微环境背景知识
肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境，它不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的（核和胞质）内在环境有关。肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展。TME的异质性使得个体间肿瘤进展存在很大差异。
在肿瘤免疫治疗领域，早已有人将肿瘤免疫的微环境分成“冷”和“热”肿瘤，“冷”肿瘤的肿瘤组织中没有或者只有很少的免疫细胞。主要是因为这类肿瘤突变数目少，从而产生免疫逃逸的现象，免疫细胞渗透进肿瘤内部。“热”肿瘤中，肿瘤细胞突变数目多，周围会聚集较多的免疫细胞，包括T细胞、巨噬细胞等，但是这些浸润性细胞会受到肿瘤的免疫抑制，从而无法有效地发挥抗瘤作用。比如说，肿瘤细胞会高表达PD-L1蛋白，并诱导T淋巴细胞等免疫细胞上高表达PD-1。二者结合，就会抑制T淋巴细胞的功能。但是这两种分型只能笼统的概括，不能具体的描述TME的异质性。
但是越来越多的证据表明，接受个性化治疗的患者具有更好的临床结局，这暗示肿瘤微环境有更多样的分型，而精密医学有可能彻底改变癌症的治疗方法。在临床研究中，肿瘤的基因组表征越来越普遍。转录组学分析为剖析TIME的复杂性、异质性以及发现新的生物标志物提供了强大的平台。
Bulk测序研究TIME的异质性
全外显子测序（WES）、RNA测序（RNA-seq）等Bulk测序为肿瘤特征提供了多方面的视角，这使我们可以进一步鉴定和优化个体癌症患者的治疗方法。尽管如此，大规模的外显子组和转录组测序提供了很多的信息，这对于常规治疗决策来说是不利的，过多的参数通常难以全面利用，反而让决策变得困难。
目前发现TME对临床结果和治疗反应具有显著的作用。破解肿瘤免疫微环境的异质性可以为患者量身定制某一具体的免疫治疗方案。但是，迄今为止，整合基因组和转录组全面评估肿瘤和整个TME仍然很少见。在下面的这篇文章中，作者为TME分类开发了一个可访问的转录组分析平台，由细胞群、信号特征、TME变化过程和癌细胞特性定义的功能基因集组成，以确保对肿瘤及其TME进行全面表征。最后，将转录组学和基因组数据整合可视化，全面的剖析TME的异质性。
作者利用已发表的文献选择了可以代表肿瘤主要功能成分以及免疫，基质和其他细胞群体的功能基因表达标记（Fges），基于转录组学的分析平台对TME进行分类。通过巨噬细胞和髓样来源的抑制细胞产生的免疫抑制作用以及与癌细胞特性有关的Fges，创建了一个手动划分的29个Fges列表。这个列表涵盖了目前已知的TME特征。每个Fges被提炼成仅包括与特定的细胞类型或相关的基因的生物过程。通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算每个Fges的相对表达水平，将其应用于各种数据类型并对样本进行评分（图1）。
通过对TME Fges的无监督聚类分析揭示了四种黑色素瘤微环境亚型。作者评估了约470种黑色素瘤的表达模式，使用29种Fges的分类清单对黑色素瘤的TME进行分类，该分析表明，黑色素瘤的分子谱可分为四个不同的微环境，分别称为（1）免疫富集，纤维化（IE / F）；（2）免疫富集，非纤维化（IE）；（3）纤维化（F）；（4）免疫耗竭（D）。
使用29种Fges进行分类产生了四种不同的TME亚型，其特征主要与免疫活性、免疫抑制性微环境和肿瘤基质（包括CAF和血管形成）有关。IE / F黑色素瘤的特征在于与血管生成和CAFs（肿瘤相关成纤维细胞）激活相关的Fges表达升高。IE黑色素瘤的特点是高水平的免疫浸润，并显示出比IE / F亚型更具免疫活性的微环境。与其他亚型相比，IE黑色素瘤的突变负荷最高，CD8 + T细胞/ Tregs和M1 / M2巨噬细胞的比例最高。
另外两个亚型F和D，具有最小比例或完全缺乏白细胞/淋巴细胞浸润，而D亚型具有最高的恶性细胞百分率。在D型黑素瘤中，随着基因组重复或缺失频率的增加，染色体稳定性会降低，这表明拷贝数变化（CNA）可能与TME亚型相关。IE亚型黑色素瘤患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）与F和D亚型患者相比明显更长，F亚型的OS最短（图2）。
图2 黑色素瘤中四种不同的TME亚型
最近北京大学第一医院肿瘤转化研究中心张宁团队与北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民团队、北京大学人民医院肝胆外科朱继业团队在Nature上发表了 “Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”的研究论文。这篇论文就是用scRNA-seq揭示肝癌免疫微环境的异质性。
图3 124例肝癌患者的单细胞图谱
首先，研究人员系统解析出肝癌免疫微环境的89个细胞亚群。通过层次聚类分析，研究人员成功解析出5种不同的免疫微环境亚型，其中包含，免疫激活型TIME-IA （Immune Activation）；髓系富集免疫抑制型TIME-ISM（Immune Suppressive Myeloid）；基质富集免疫抑制型TIME-ISS（Immune Suppressive Stromal）；免疫排斥型TIME-IE（Immune Exclusion）;免疫驻留型（Immune Residence），组合起来称之为TIMELASER分型系统（图2）。
随后，研究人员对这五种免疫微环境亚型进行了多维度的分析，通过大规模转录组数据验证五种亚型的存在；通过空间转录组数据和CODEX多色免疫技术揭示五种亚型的细胞空间分布；通过受体配体分析发现每种亚型均存在不同的趋化因子受体-配体网络，提示了不同亚型的形成机制；联合外显子数据分析发现不同的亚型富集不同的驱动基因突变，如TP53、CTNNB1、KRAS和IDH1，并发现不同的亚型富集不同的肿瘤细胞基因组。这五种免疫微环境的发现为肿瘤免疫治疗提供了重要的参考信息（图4）。
图4 肝癌的五个TIME亚型
TME亚型的思路汇总
RNA测序(RNA-seq)在过去十年里逐渐成为全转录组水平分析表达和研究mRNA差异剪接必不可少的工具，其中表达水平的探究是转录组领域最热门和基础的方向：利用转录组数据来识别转录本和表达定量，从而对造成细胞/组织/个体间不同状态的差异的内部原因进行诊断分析，挖掘关键基因。
以肿瘤微环境为例，TME中的细胞的转录组等遗传信息一定是存在差异的，而传统的研究手段通常将TME作为一个整体进行研究，或者将TME进行简单的分割，得到每一部分细胞基因表达的平均值，丢失了每个细胞的异质性信息，使科研人员对肿瘤微环境中各种细胞转录本表达及免疫功能的理解不够深入。由此可见，为了得到原始和真实的细胞遗传信息，对转录组的分析应该在单细胞水平上展开。单细胞测序能够获取每个单个细胞的遗传信息，检出混杂样品中的异质性细胞。（图5）。
图5 TME亚型的思路汇总
全文总结
TME在局部耐药、免疫逃逸和远处转移等多个肿瘤发生发展的步骤中起关键作用，而肿瘤发生转移也依赖于TME中的各种细胞及因子的相互作用，因此基于TME的特殊作用，针对不同个体TME的不同，选择个体化综合治疗是至关重要的。本文虽然内容不是很多，但亮点很突出，使用相关的算法可以得到肿瘤微环境各种亚型，并对相关的免疫特征进行全面的分析，同时紧密结合临床，使用相关的数据和细胞、动物实验进行验证。这样就可以熟练研究TME的异质性了。
参考文献
1. Bagaev A, Kotlov N, Nomie K, et al. Conserved pan-cancer microenvironment subtypes predict response to immunotherapy. Cancer Cell Jun 14 2021;39(6):845-865 e847.doi:10.1016/j.ccell.2021.04.014.
2. Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature Nov 9 2022.doi:10.1038/s41586-022-05400-x.
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