2023年4月，发表在Cell Metabolism IF 31.3 Q/1 题目为“Extracellular vesicles in fatty liver promote a metastatic tumor microenvironment”的文章，告诉你，老树到底如何开新花...
肝转移是癌症（CRC）患者死亡的主要原因。脂肪肝促肝转移，但其潜在机制尚不清楚。作者证明肝细胞来源脂肪肝细胞外小泡通过促进CRC肝转移致癌Yes相关蛋白（YAP）信号传导和免疫抑制微环境。脂肪肝上调Rab27a的表达，促进肝细胞产生EV。在肝脏中，这些EV将YAP信号调节微小RNA转移到癌症细胞，通过抑制YAP活性LATS2.脂肪肝CRC肝转移中YAP活性的增加促进了癌症细胞的生长和通过产生CYR61的M2巨噬细胞浸润的免疫抑制微环境。患者CRC肝转移和脂肪肝的细胞核YAP表达、CYR61表达和M2表达升高巨噬细胞浸润。作者的数据表明，脂肪肝诱导EV微小RNA、YAP信号传导和免疫抑制微环境促进CRC肝转移生长。
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转移前微环境个性化思路
一、背景
肥胖和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是CRC的重要危险因素。全球有超过6.5亿成年人患有肥胖症，NAFLD的增加与肥胖流行有关。越来越多的流行病学证据表明，脂肪肝增加了CRC肝转移的发生率和局部复发率，从而恶化了预后。同样，通过改变肝脏炎症和免疫微环境，脂肪肝增强了动物模型中CRC肝转移的转移性肝肿瘤生长。这些发现表明，由于脂肪肝中肿瘤微环境（TME）的异质性可能解释了患者之间癌症治疗反应的多样性，因此转移机制可能不同。因此，在具有或不具有脂肪肝的患者中，对于治疗CRC的转移管理可能不同。迫切需要了解具有脂肪肝患者的转移分子机制以有效地管理这些患者。
该研究揭示了脂肪肝产生的EV包含促癌miRNAs，并创建了一个预转移和促转移的肝微环境，使其易于发生CRC肝转移。的结果表明，从脂肪肝肝细胞向转移性癌细胞的EV转移促癌miRNAs可以通过抑制LATS2增加YAP活性。表明，高度的YAP活性通过增强M2-TAM招募和CD8 T细胞耗竭来促进CRC肝转移生长，从而创建免疫抑制微环境。因此，NAFLD可能会产生复杂的、转移性的TME，从而促进CRC肝转移。此外，近年来全球NAFLD负担的增加可能解释了对于患有CRC和肝转移的患者癌症治疗的不同反应。
二、结果
1.脂肪肝释放的细胞外囊泡增加促进了肝脏转移性肿瘤的生长
野生型（WT）小鼠喂食低脂肪饮食（LFD）或高脂肪饮食（HFD）6周后脾注射同基因MC38 CRC细胞额外2周建立结直肠癌肝转移模型或没有脂肪肝（图1）。
HFD导致转移性肿瘤的数量和大小增加，同时血清EV颗粒也在增加（图1A-1C）。
与未经EV处理的细胞相比，经LFD喂养小鼠的血清EV处理增强了MC38细胞的增殖、迁移和侵袭（图1D-1F）。
当使用HFD喂养小鼠的ev治疗时，癌症侵袭性进一步增强（图1D-1F）。
人类样本中，NAFLD患者的血清ev数量高于健康对照组，并与肝脏脂肪含量相关（图1C）。表明来自NAFLD患者的ev促进了侵袭性结直肠癌（图1D-1F1）。
这些结果表明，脂肪肝中Rab27a表达的增加促进了肝转移，可能是通过Rab27a介导的EV的产生。
2.MiRNAs是加重脂肪肝中结直肠癌生长的功能性细胞外囊泡内容物
为了鉴别，哪些EV含量对脂肪肝患者CRC肝转移的增加是重要的。作者使用健康个体、NAFLD、LFD喂养和HFDfed小鼠的小鼠、HFD喂养小鼠和pa处理小鼠的肝细胞进行了定量miRNA PCR阵列（图2A）。
利用这5个队列，作者确定有6个mirna通常表达上调，脂肪肝肝细胞和pa-治疗肝细胞来源的ev通常含有促癌原rna。
接下来，研究了miR-25、miR-92和miR-103在CRC细胞中的功能作用。PA处理上调了来自小鼠肝细胞和Huh7细胞的ev中miR-25、miR-92和miR-103的表达。这些miRNAs被pa处理的细胞中的MC38和HCT116细胞吸收。
在用miR-25、miR- 92和miR-103模拟物处理的MC38和HCT116细胞中，增殖、迁移和侵袭均增加（图2B、2C）。在ev中，结合两种或三种miRNA抑制，可降低经pa处理的肝细胞的ev的致瘤作用（图2D、2E）。
这些发现支持了miR-25、miR-92和miR-103是脂肪肝中致癌EV的因素。
3.含有miRNAs的细胞外囊泡调节结直肠癌细胞的致瘤前YAP信号
为了寻找EV-miRNAs的直接靶点，作者结合了三种靶基因预测算法，靶标、miRDB和PicTar，并基于基因本体和KEGG通路数据库选择了人类和小鼠中经常预测miR-25、miR-92和miR-103的肿瘤抑制基因（图3A）预测肿瘤抑制基因。
LATS2的表达，YAP的负监管机构信号，显著下调（图3B），和核和phospho-YAP蛋白的表达增加和减少，分别在MC38和HCT116细胞处理miR-25，miR-92和miR-103模拟（图3C、S3B和S3C）。
基因分析和诱变研究证实，miR-25、miR-92和miR-103结合到Lats2的30 UTR区域，以调节MC38细胞中Lats2的表达（图3D和3E）。
同样，来自pa处理细胞的ev降低了LATS2并增加了核YAP表达，而ev中miR-25、miR-92和miR-103的复合抑制增加了MC38和HCT116细胞的LATS2并降低了核YAP表达（图3F、3G）。
联合抑制miR-25、miR-92和miR-103可抑制来自脂肪肝肝细胞的YAP核易位。作者的数据表明，ev中的miR-25、miR-92和miR-103通过下调LATS2来促进YAP的激活。
4.在非酒精性脂肪肝增强的结直肠癌肝转移灶中，YAP活性增加
作者检测了HFD喂养和LFD喂养的小鼠转移性肿瘤的基因表达谱文件。基因集合富集肛门溶解（GSEA）表明，YAP和致癌信号在HFD-fed小鼠的肿瘤中富集（图4A），支持脂肪肝增加YAP活性和癌症侵袭性。
为了验证EV调控脂肪肝中YAP活性的假设，作者检测了YAP的核定位和YAP靶基因的表达。在转移性肿瘤中，HFD喂养增强YAP核定位，增加YAP及其靶基因（Ankrd1、Axl1、Ccn2和Ccn1）的表达，下调Lats2的表达，而不是Lats1（图4B-4D）。
通过沉默体内肝细胞中的Rab27a，检测了ev在YAP表达中的作用。Rab27a沉默逆转了HFD喂养小鼠转移性肿瘤中Lats2表达降低，核YAP和YAP靶基因表达增加（图4E和4F），证实了作者关于EV在脂肪肝转移性肿瘤中调节YAP活性的假设。
5.YAP信号通路促进转移性肿瘤的生长和脂肪肝中的免疫抑制环境
因为EV的产生与脂肪肝肝转移中的YAP的活性有关（图4E和4F），作者研究了YAP在来自含脂肪肝细胞的EV的致瘤作用中的作用。
经pa处理的肝细胞ev处理的CRC细胞的增殖、迁移和侵袭增加，但当Yap1被沉默时，这些特征减弱（图4G）。
进一步研究了YAP在体内肝转移中的作用。在HFD喂养6周后，将对照组和yap1沉默的MC38细胞接种到小鼠体内，结果发现YAP促进CRC的显著特征。
研究了YAP诱导的体液介质是否有助于癌细胞-TAM的相互作用。与未共培养的MC38细胞相比，与WT MC38细胞共培养的肝巨噬细胞增加了肝巨噬细胞的迁移，而在MC38细胞中敲除Yap1则减少了肝巨噬细胞的迁移（图5B）。
为了研究CYR61在癌细胞中对巨噬菌体活性的作用，作者在MC38细胞中沉默Ccn1基因，并将肝巨噬细胞与MC38细胞共培养。当Ccn1在MC38细胞中被沉默时，肝巨噬细胞的迁移和巨噬细胞的M2极化被抑制（图5E）。
体内实验证实了作者的体外数据，表明当癌细胞中Ccn1被沉默时，脂肪肝中M2-TAM浸润和M2巨噬细胞基因表达的增加被抑制（图5F）。
值得注意的是，癌细胞中Ccn1沉默仅降低了脂肪肝小鼠的肿瘤生长（图5G和5H），但不影响脂肪肝的程度，在LFD喂养的小鼠中下调Ccn1不影响肿瘤生长和TAM浸润，也不影响体外CRC行为（集落形成、迁移和侵袭）。
这些结果表明，CYR61介导CRC细胞和M2- TAMs的迁移，促进脂肪肝肿瘤的生长。
6.高脂饮食和YAP信号通路有助于建立免疫抑制肿瘤微环境
为了进一步研究M2-TAMs的异质性，对转移性肿瘤中的免疫细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。无监督的聚类识别出了22个聚类（图6A）。用已知标记表达的聚类注释主要细胞类型。
HFD喂养没有改变总M2-TAMs的比例（图6A和6B），重新聚集了M2- TAMs，并在HFD喂养的小鼠中确定了富集的M2a和M2b样亚群（图6C）。差异表达基因的分析显示HFD喂养小鼠的M2-TAMs有显著的改变（图6D、6E）；
CYR61受体成分整合素av在M2-TAMs中大量表达，但另一种受体成分整合素b5在M2带m2c样亚群中富集，并通过HFD喂养富集（图6C-6E）。
这些数据表明，脂肪肝增强了免疫抑制的TME，包括M2-TAMs、SAM/LAM和CD8 T细胞，部分由肿瘤来源的YAP活性介导。
7.结直肠癌肝转移和非酒精性脂肪肝患者的YAP活性增加和免疫抑制肿瘤微环境
为了提高作者研究的临床意义，作者检查了伴有或没有脂肪肝的CRC肝转移患者的组织样本。临床特征显示，在非脂肪肝患者中，癌细胞偶尔出现核YAP和细胞质CYR61阳性，而在脂肪肝患者中，核YAP和细胞质CYR61阳性丰富，M2-TAMs在脂肪肝患者的转移性肿瘤中的作用更多（图7A-B）。
为了进一步研究有脂肪肝或无脂肪肝的结直肠癌肝转移患者的免疫微环境，作者采用成像质量细胞学测量（IMC）用金属离子偶联抗体进行多重组织成像。使用组织芯片（TMA）对29个蛋白靶点进行了空间分析(图7C）,绘制了构成肝脏和TME的细胞群。
免疫细胞被重新克隆到T细胞、B细胞、TAMs和其他髓系和淋巴系细胞群（图7d）。TAMs被分为M1、M2和其他子集（图7E和7F）。
NAFLD患者的M2-TAMs水平升高。Immune检查点分子在M2-TAMs中富集，并且TIM3在NAFLD患者中的表达高于健康肝脏患者（图7F）,而CD8 T细胞在NAFLD患者的肿瘤中富集（图7G）。
NAFLD患者的调节性T细胞中PD-1和PD-L1均较高，而NAFLD患者的所有T细胞亚群中VISTA和TIM3均较高（图7H）。
进一步检测了YAP和原发和转移部位Ki67的表达。有趣的是，来自NAFLD的原发性结直肠癌样本的YAP和Ki67表达高于健康肝脏，而转移性肿瘤的表达高于原发肿瘤（图7I）。
通过测量免疫细胞和转移性肝肿瘤之间的距离来检验空间分析。M2-TAMs位于yap阳性肿瘤附近（图7J）。相反，CD8 T细胞对YAP阳性肿瘤的位置比对YAP阴性肿瘤的位置更远。
这些结果表明，NAFLD患者中免疫抑制的M2-TAMs和T细胞表达丰富，癌细胞中YAP的表达可能影响免疫细胞与癌细胞之间的距离，从而调节转移性肿瘤的侵袭性。
三、结论
在这篇文章中，作者发现Il1b在HCC转移前肺微环境中显著增加，并通过上调SAA3水平和增加MMP9+细胞来促进转移前微环境的形成，从而促进HCC的肺转移。研究结果表明，靶向IL-1β/SAA3轴可能是预防晚期HCC肺转移的一种潜在疗法。肺泡巨噬细胞、上皮细胞和髓细胞之间的通讯协调了转移前肺微环境的形成，并促进了HCC的肺转移。靶向IL-1β/SAA3轴可能是一种潜在的抗转移治疗方法。
四、思路衍生
转移前微环境形成，原发肿瘤和靶器官相互配合就是个你情我愿的过程！肿瘤转移过程中，肿瘤细胞历经离开原发部位，内渗进入血管，随血液远行，从血管外渗到远处器官，最终在靶器官定植（colonization） 而生长成为转移性癌灶。
说了这么多，最重要的，小编已经整理好多种思路和数据集了，兼顾创新和临床意义！想推成出新的科研人，冲鸭～
转移前微环境个性化思路
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