2024年11月4日，国际化学类顶级期刊《德国应用化学国际版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上发表了题为《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究论文。该工作由复旦大学医学院胡璐璐研究员团队、华山医院消化科刘杰主任团队、美国芝加哥大学何川院士团队携手柏锘（上海）医疗科技有限公司共同完成。
液体活检技术通过收集血液中来自各种组织的游离DNA（cfDNA），对其中包含的生物标志物（如基因突变、甲基化或羟甲基等表观修饰）进行检测，具有无创、高效的特点。与传统的各种检测技术（例如胃肠镜、血清标志物）相比，液体活检在临床上具有革命性的优势，在癌症等疾病的早筛早诊、预后监测、疗效评估等诸多方面有广阔的应用前景。
DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，可在肿瘤发生的早期被检测到，且具有较好的稳定性，因此成为肿瘤液体活检中一个极具价值的生物标志物。但是，目前基于亚硫酸氢盐测序技术的甲基化检测方法，很难避免DNA的降解；高通量测序成本较高；PCR检测涵盖的位点有限，因此开发一种成本低、中通量且又可靠的新检测方法，是非常具有现实意义的。
研究团队新开发的LAMP-MS方法创造性地将线性扩增和飞行时间质谱技术结合在一起，只需要1ng血浆cfDNA，通过多重PCR和单碱基引物延伸，能够在较短时间内同时检测数十个甲基化位点。该技术主要操作步骤如图1所示：
图1 LAMP-MS方法流程图
LAMP-MS的完整工作流程：
从血浆中提取1ng的cfDNA样本，经过末端修复后，用含有甲基化双链T7启动子的DNA接头进行连接。在亚硫酸氢盐处理后，非甲基化的胞嘧啶（dC）转化为尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不变。使用T7 RNA聚合酶进行无偏好性线性扩增，产生微克数量级的RNA产物。随后的逆转录产生同样是微克水平的cDNA。通过序列特异性PCR对含有特定DNA甲基化位点的DNA片段进行指数扩增。对特定的DNA片段进行文库构建和浅测序，称为靶向LAMP-Seq。利用位点特异性引物进行单碱基延伸，如果延伸位点进入的是ddATP，代表此处为未甲基化的C，如果是ddGTP则代表甲基化的5mC，通过这种方法判断待检测位点是否甲基化。根据核酸质谱图上峰的位置，计算出ddG/ddA，即5mC/C。
为验证LAMP-MS方法的性能，研究团队合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探针，利用1ng的上述探针对LAMP-MS方法进行了测试，发现即使是5%的甲基化含量，该方法也可以实现灵敏地检测（图2A），标定曲线也表明检测准确性和理论值高度吻合（图2B）。
图2 使用1ng 5mC探针验证LAMP-MS方法的灵敏度和准确性
在临床上，来自癌症患者血浆cfDNA样本的生物标志物丰度因人而异，因此研究团队进一步利用真实世界样本对LAMP-MS方法进行了验证。从10名结直肠癌患者和10名非结直肠癌患者中各获取1ng的cfDNA样本，检测了结直肠癌筛查中最具有代表性的标志物——SEPTIN9基因的4个甲基化位点，发现LAMP-MS与高通量测序结果有很好的一致性（图3）。
图3 在结直肠癌和非结直肠癌患者中验证LAMP-MS方法
研究团队认为，同样的策略也可以拓展到RNA的定量检测中，例如在大多数高等生物mRNA中含量最丰富、并且对于生命过程起着重要调节作用的m6A修饰的检测。
研究团队将已发表的GLORI技术和核酸质谱有机整合成为m6A核酸质谱方法。该方法从HELA细胞中提取mRNA，将未甲基化的腺嘌呤转化为肌苷，保留甲基化的m6A。经过末端修复、加接头，再将mRNA反转录成cDNA，作为模板进行指数扩增，然后通过核酸质谱单碱基延伸，加入ddATP代表检测位点对应m6A，ddGTP对应未甲基化的腺嘌呤。对比HELA细胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A），及其各自邻近的非甲基化腺嘌呤位点，证明该m6A核酸质谱方法能够进行有效地RNA甲基化定量检测（图4）。
图4 m6A核酸质谱方法：流程及验证
该研究表明，LAMP-MS（及m6A核酸质谱方法）可以实现超低量样本的甲基化检测，且结果可以直接可视化，不需要高通量测序繁复的数据分析处理过程，因此有潜力作为表观遗传学领域重要的实用工具，为科研工作者的实验室研究和临床样本检测提供了广阔的应用前景。
论文原文：
Lulu Hu, Runyu Xie, Xiaotong Yang, Weizhi He, Zhongguang Luo, Wenshuai Li, Chu Xu, Xiaolong Cui, Ning Wei, Xiaolan Wang, Yixiang Shi, Chuan He, Jie Liu, Wei Zhang. LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input. Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202413872.
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