技术交流 | 光学基因组图谱分析技术在不良生育史患者遗传学病因分析中的应用

南通大学附属医院妇产科，南通 226001

通信作者：张玉泉， Email：jsnt_zhangyuquan@163.com

引用本文：张建林,张俊荣,邓艳,等. 光学基因组图谱分析技术在不良生育史患者遗传学病因分析中的应用[J]. 中华妇产科杂志,2024,59(06)：470-475.

DOI:10.3760/cma.j.cn112141-20240104-00011

基因组SV通常指长度>50 bp的DNA片段变化，主要包括缺失、重复、倒位、易位、插入等多种类型 ^［ 8 ］ ，SV通过剂量效应、位置效应影响基因调控、转录等，最终造成翻译产物——蛋白质的质和量及功能异常，可造成育龄期夫妇自然流产、不孕不育等，故对生育异常者有必要进行基因组SV的检测。

染色体核型分析是SV检测的经典技术，但该方法需要细胞培养，操作流程繁琐、周期长、分辨率低且依赖于操作人员 ^［ 9 ］ ，400条带水平只能识别10 Mb以上的结构改变，会造成隐匿性平衡性结构重排、复杂结构重排漏诊和误诊。FISH技术在识别靶向区域基因组拷贝数异常及位置变化方面的准确度和特异度高，但高度依赖探针的设计，无法覆盖全基因组 ^［ 10 ］ ，目前常用于特定位点的定性、定量和定位验证。SNP array等分子检测技术在判断微缺失及微重复方面的分辨率较染色体核型分析提高了100多倍，但无法识别平衡性结构重排 ^{［ 11 , 12 ］} ，因此无法检测出表型正常的携带者。作为携带者，其生殖细胞减数分裂时产生的不平衡配子与正常配子受精，受精卵会因遗传物质的重复或缺失而出现流产等不良妊娠结局。由于人类的SV几乎涉及每号染色体的每条区带，其种类多、跨度大，常需要不同技术的联合诊断。OGM技术自Schwartz等 ^［ 13 ］ 首次报道以来逐渐被人们所认识，其分辨率高、全基因组覆盖，一次检测能够识别包括平衡和（或）非平衡的隐匿性复杂染色体畸变在内的多种基因组异常，有助于不良孕产史夫妇的遗传学病因分析。

1. 基本原理：OGM技术借助特殊的荧光转移酶DLE-1特异性识别基因组DNA上CTTAAG碱基序列并标记上DL-Green荧光基团，使基因组该序列位置连接上绿色荧光标记，再用蓝色染料对双链DNA分子骨架染色。将标记过的DNA分子载入Saphyr芯片，并在电泳低压电场作用下使其通过纳米通道阵列实现线性化 ^［ 14 ］ 。DNA分子被拉直的同时进行高分辨率荧光成像，即可获得一系列带有绿色荧光信号的长片段蓝色DNA分子图像，所得图像与人类基因组参考序列进行比对，从而实现对基因组异常，即CNV和SV的检测。

2. 检测范围：OGM作为一种长读长光学图谱技术，基于超长单分子DNA检测和分析技术平台，系统以100 kb~1 Mb级别读长实现超高灵敏度的SV分析和组装，能够在全基因组范围内一次性检测低至500 bp的SV和CNV。通过SV算法和CNV算法，OGM技术能够识别非整倍体、微缺失或微重复、大的CNV（>10 Mb）、插入、平衡易位、倒位、等臂染色体、双着丝粒染色体、串联重复、四倍重复、复杂结构重排、纯合性区域和融合基因等，同时能够明确断点所在区间和变异方向 ^{［ 4 ， 15 , 16 , 17 , 18 ］} 。本研究中，例3 为染色体核型分析未见明显异常的无精症患者，OGM检测结果发现Yq11.223q11.23 区域存在半合子缺失，缺失可造成男性无精、少精。例3的检测结果说明，OGM技术在检测微缺失方面有效、准确。由于染色体核型分析对男性不育症的遗传学病因诊断率不足20% ^［ 19 ］ ，OGM技术可以替代染色体核型分析作为此类患者的首选方案。

3. 优势及局限性：OGM技术在检测过程中保留了长片段DNA的结构信息，不需要片段化后重新映射回参考基因组，因而可对基因组片段在数量和结构上的变化进行高分辨率的直观判断。相较于染色体核型分析，OGM技术的分辨率提升了10 000倍，其对断点所在区间、串联重复的正反位置以及重复片段的插入区间能够准确判断，对隐匿性和（或）复杂结构重排的准确分析更显示了其独特优势。同时，OGM还弥补了SNP array无法识别平衡性结构重排的缺陷，且全基因组覆盖的检测范围远超FISH。作为新一代细胞遗传学技术，OGM兼具染色体核型分析、SNP array、FISH的检测能力，对现有遗传学诊断体系是一种有益补充。本研究中例1患者7号染色体长臂臂内倒位，由于涉及的倒位片段小，未能被常规核型分析确认，SNP array检测也因无遗传物质的丢失而漏诊，但该病例得到了OGM技术的准确判断，由此证明了其在识别微小的、隐匿性的平衡性结构重排方面的能力，可为此类患者的风险评估、遗传咨询、再生育指导提供科学依据。因此，当临床评估异常，但常规检测未发现异常的病例，可以考虑OGM检测。

OGM技术的局限性源于该技术长片段DNA分子上特定荧光序列模式与人类基因组参考序列的差异分析，因此，对于人类参考基因组的空白区域，如染色体的端粒、着丝粒、D组或G组染色体的短臂，以及常见异染色质区域的改变，OGM会造成漏诊 ^［ 20 ］ ，本研究中OGM未能识别的异染色质和随体（例4）证明了这一观点。值得注意的是，OGM能够检测出的平衡易位并不包括断裂位点都在着丝粒DNA重复序列内部的罗伯逊易位和整臂易位；双着丝粒染色体检出的前提是断裂位点要在着丝粒DNA重复序列之外；对于插入，需要片段足够长且荧光模式足够特异才可以明确来源；对于等臂染色体，OGM会检测到整条染色体臂的CNV，但圈图没有着丝粒融合的提示，因此无法就此推断是否形成等臂染色体。染色体倒位和涉及同源染色体间的易位无法区别；环状染色体，无法区别长短臂亚端粒缺失造成的连接，还是同源染色体的不平衡易位而产生；标记染色体无法仅仅依靠OGM推断其整合在染色体内，还是以游离的小片段DNA形式存在 ^［ 18 ］ 。此外，OGM对嵌合体的诊断效果欠佳，如文献中的低比例非整倍体嵌合 ^［ 17 ］ ，以及本研究例2 患者嵌合的衍生染色体的SV均未能够识别出。9号染色体臂间倒位也有漏诊现象 ^［ 17 ］ 。

4. 临床应用：目前，多项回顾性研究对于OGM在生殖医学、血液系统肿瘤、实体瘤、遗传病、罕见病等领域的应用已进行了性能评估^{［4，21, 22, 23, 24 ］} ，但仅几项研究结果与标准检测方法的结果100%符合 ^［ 25 ］ 。前瞻性研究主要在产前诊断领域，样本量最大的单中心研究探讨了OGM在检测非整倍体、微缺失或微重复、平衡性结构重排（平衡易位、插入和倒位）和不平衡重排等方面，与染色体微阵列分析技术（chromosomal microarray analysis，CMA）及染色体核型分析的一致性，结果发现，OGM与CMA的一致性为95.56%，原因在于OGM漏检了2例嵌合非整倍体，但同时额外检出了CMA未发现的8例SV，主要涉及平衡易位、插入和倒位；OGM与染色体核型分析的一致性为75.68%，原因在于OGM识别出更多不平衡重排的同时也因技术局限漏检了涉及着丝粒的平衡易位、低水平的嵌合非整倍体、9号染色体的臂间倒位、罗伯逊易位和22ps+中的随体等 ^［ 17 ］ 。研究显示，尽管相较于CMA和染色体核型分析，OGM的诊断率最高，但其无法取代标准检测技术单独使用 ^［ 17 ］ 。鉴于OGM和染色体核型分析的联合诊断效果与OGM、CMA和染色体核型分析三种技术联用时相当，可将OGM和染色体核型分析作为产前基因诊断的综合解决方案 ^［ 17 ］ 。

基于文献回顾 ^{［ 26-28 ］} 和对本研究中的病例分析，本研究组认为，OGM提高了小片段SV的检出率，能够减少因检测技术分辨率低、不能覆盖全基因组或不能识别平衡性结构重排等技术局限性造成的误诊和漏诊，可将其用于下列情况：（1）染色体核型分析无法确定是否存在复杂SV和（或）SV的类型，以及区带定位不确定的病例；（2）染色体核型分析、CMA和全外显子测序等标准检测技术未发现异常，但高度怀疑存在遗传学改变的病例；（3）流产和（或）引产组织遗传学检测结果提示双亲之一可能为隐匿性平衡性结构重排携带者；（4）CMA检测提示存在小片段增加，不明确以游离的形式存在，还是在原有位置的正向或反向重复，或者以插入的形式处于其他位置的病例；（5）特定的动态突变诊断，如面肩肱型肌营养不良症1型和脆性X染色体综合征。