“WB”，中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹，Western Blot。
其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后，按分子量大小顺序在分离胶中分离开来，通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体（通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜）表面，然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质，再加入酶或者荧光素标记的二抗，二抗与一抗结合反应后，通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。
由于本实验的时间长、细节多，从制备样本到显影，每一个步骤都可能存在不同程度的问题，最后得到的条带往往各式各样、不尽人意。那么常见的WB条带问题，主要有以下几方面：
1、高背景
2、多条带
3、信号弱
4、其他常见问题
一、膜背景高
原因分析：
1、封闭不充分
解决方案：更换新鲜的封闭液（5%的脱脂奶粉或者3%的BSA），或者购买快速封闭液，因为现在的封闭体系较为稳定，一般试剂公司的封闭液都比较合适，可以尝试使用，这里推荐碧云天家的快速封闭液，我自己用下来基本能够避免膜有高背景的情况发生。
2、洗涤不充分
解决方案：增加洗涤的次数和时间，除去非特异性结合。一般来说，洗涤通常是6min，洗涤4次，摇床速度调到110rpm，根据个人经验，可以调整为10min/次，洗涤3次，摇床速度调为130rpm，会洗的更加干净，也能避免高背景。
3、膜干燥
解决方案：在曝光的时候，膜放在机器里的时间过长，会导致膜的干燥。因此，在用发光液的时候，最好把膜放在发光液中浸泡一会儿。在曝光时间大于5min的情况下，建议将膜取出来，再次浸泡发光液，重新放入机器曝光。
二、多条带出现（非特异性条带、多带、杂带）
原因分析：
1、蛋白降解
解决方案：在制备蛋白样品中，通常是配置含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，在配置裂解液时候，最好两个抑制剂最后放，适当涡旋混匀后，及时加入进培养皿中，冰上裂解，有效预防蛋白降解。蛋白提取结束后，放入-80℃中保存，若短期内需要使用，则需要分装保存，避免反复冻融。
2、一抗浓度过高
解决方案：当膜曝光出来，出现多条带时，可以通过稀释一抗的浓度来进行调整。
3、二抗浓度过高
解决方案：降低抗体浓度，增加二抗对照（即不加一抗）。
4、蛋白本身有多种修饰形式
解决方案：通过查阅文献，查找关于目的蛋白是否存在多种修饰，如泛素化、糖基化等修饰会导致目的条带发生较大的偏移。
5、目的蛋白存在剪切体，导致分子量的大小不同
解决方案：若通过搜素数据库确定该蛋白存在多种长度不同的编码mRNA，那么，在制备蛋白的时候，就应该尤为注意，减少提取蛋白前对细胞的消化。
6、上样量过多
解决方案：根据靶标情况，梯度上样跑胶后选择适合的上样量，通常为20-30ug即可。
三、信号弱或空白膜
原因分析：
1、如果没有膜上marker，考虑转膜失败
解决：及时更换新鲜的转膜液，并检查蛋白转移的效率和时间是否合适。
2、PVDF膜未激活
解决方案：用甲醇激活PVDF膜1min，后用纯水洗涤1min，加入冰镇的转膜液，浸泡10min，备用。
3、一二抗不匹配：如果marker正常，其他位置没有条带，可能是抗体加错了。
解决方案：检查一抗和二抗的种属，二抗要和一抗宿主的物种相同，如一抗是兔抗，那么二抗应该是某抗兔；如果内参是正常的，那么，可能是一抗失效或二抗用错。
4、目的蛋白含量低
解决方案：浓缩使信号最大化，同时增加高表达的阳性对照组，避免操作中出现的问题。
5、如果中间出现细微条带，可能是上样量过少，或一抗浓度过低。
6、如果内参和目的蛋白均无信号，那么考虑是否为发光液失效。
四、其他问题
1、条带粘黏
解决方案：由于上样量太多，样品串孔了，可以通过减少上样量来避免。
2、条带上出现空白
分析：可能是转膜时，有气泡未赶出，三明治制备未夹紧，或是放入转膜槽中产生气泡。
解决方案：可以通过制备三明治时，仔细看有无残留气泡，并赶出。在放入转膜液之后，静置10min，排出气泡，再进行转膜。
3、M形状条带
分析：制胶的问题，胶没有压缩好
解决方案：自己配的胶容易出现多种问题，不是特别稳定。因此，建议使用预制胶，预制胶的工业化生产更加稳定不易出问题。
以上为本人再WB实验过程中，出现过的问题和解决的方案，希望对大家有参考意义。
本文作者是"大棚玫瑰"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：大棚玫瑰
校对：煲仔饭
素材：
https://images.app.goo.gl/XjuTHzYsRTBWxFEL9
手把手教学——Western Blot全流程实验步骤及常见问题详解
手把手教学——WB条带量化之ImageJ软件分析
关于WB，你不得不注意的小细节（一）
