来源：中华妇产科杂志 2024年6月第59卷第6期作者：韩子川 田甜 张楠 王嘉祥 杨蕊
北京大学第三医院妇产科生殖医学中心 国家妇产疾病临床医学研究中心 辅助生殖教育部重点实验室 北京市生殖内分泌与辅助生殖技术重点实验室， 北京 100191
通信作者：杨蕊， Email：yrjeff@126.com
引用本文：韩子川,田甜,张楠,等. 线粒体异常在多囊卵巢综合征患者卵泡发育异常中作用的研究进展[J]. 中华妇产科杂志,2024,59(06)：486-491.DOI:10.3760/cma.j.cn112141-20240116-00039
多囊卵巢综合征（PCOS）常见于育龄期妇女，是常见的生殖和内分泌疾病，存在激素、糖脂及炎症因子水平的紊乱。PCOS患者主要表现为卵母细胞成熟障碍，其卵泡细胞（包括卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞等）中线粒体基因存在异常的遗传变异，同时线粒体数量、结构和功能也受到体内异常代谢水平的影响。上述变化会引发卵母细胞能量供应障碍、氧化应激以及颗粒细胞过度凋亡，与PCOS患者的卵母细胞质量和生育力下降有密切关系，本文对此进行综述，并探讨线粒体相关指标在辅助生殖治疗过程中用于卵母细胞质量评估的作用，可以通过分析卵母细胞内代谢辅酶的荧光影像、检测颗粒细胞线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位等指标，对PCOS患者的卵母细胞质量进行评估，从而预测辅助生殖治疗结局。囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是妇科常见的生殖和内分泌疾病，以少或无排卵、高雄激素血症和（或）高雄激素临床表现以及卵巢多囊样改变（超声检查提示卵巢体积>10 ml或直径2~9 mm卵泡的数量≥12个）为主要特征 ［ 1 , 2 ］ ，常伴有脂代谢紊乱及肥胖、糖代谢紊乱及胰岛素抵抗、氧化应激和慢性炎症等。PCOS患者的卵母细胞质量较差，受精率、卵裂率和着床率均较低，形成的胚胎流产率较高，患者的生育力受到严重影响 ［ 3 , 4 ］ 。卵母细胞成熟包括核成熟和胞质成熟，核质成熟能否正常进行是决定卵母细胞质量的关键因素。卵母细胞经过核膜破裂、纺锤体装配和染色体分离，最终停滞在第二次减数分裂中期，称为卵母细胞核成熟；胞质成熟包括细胞骨架动力学、细胞器重新分布和蛋白质的表达，以适应卵母细胞成熟阶段不同的功能需求 ［ 5 ］ 。真核细胞的线粒体内膜分布有氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）复合物Ⅰ~Ⅴ，可以利用有机物氧化释放的能量合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），是细胞内有氧呼吸的主要场所。同时，线粒体也在细胞中发挥着控制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平、调节细胞凋亡等重要作用 ［ 6 ］ ，是影响卵母细胞成熟，继而影响其质量的关键因素。PCOS作为一种内分泌代谢性疾病，具体致病原因目前尚未明确，而线粒体作为细胞内主要承担代谢功能的细胞器，其与PCOS发病机制和疾病特征的关系受到了广泛关注。在既往针对PCOS患者线粒体的研究中，部分观点倾向于将线粒体异常归为疾病本身的遗传缺陷 ［ 7 , 8 , 9 ］ ，部分观点则将线粒体异常视作与糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗等异常代谢表型并行发生、相互影响的原发特征 ［ 10 , 11 ］ 。目前的研究表明，PCOS患者卵泡细胞［包括卵母细胞、颗粒细胞、卵丘细胞（cumulus cell）以及卵泡膜细胞］［ 12 ］ 线粒体异常与卵母细胞质量下降有密切关联。故本文试将上述两种观点结合，从PCOS患者的高雄激素血症、脂代谢紊乱等内分泌代谢特征以及线粒体基因和表观遗传异常两方面揭示其卵泡细胞线粒体数量、结构和功能异常的可能机制，并综述PCOS患者卵泡发育过程中的线粒体异常及其对卵母细胞质量的影响（ 图1 ），以期揭示PCOS患者生育力下降的机制，从而为临床诊疗提供依据和线索。![]()
PCOS患者的内分泌代谢特征和线粒体基因特征是影响其卵泡细胞线粒体数量、结构和功能的两个主要因素。（一）PCOS内分泌和代谢特征对卵泡细胞线粒体的影响线粒体在卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用，同时其对内环境的变化较为敏感 ［ 7 ］ 。而PCOS属于内分泌代谢紊乱型疾病，常伴有高雄激素血症、脂代谢紊乱、糖代谢紊乱和慢性炎症等表型。研究表明，PCOS高雄激素血症、胰岛素敏感性改变等特征可能通过改变卵泡微环境，导致卵泡细胞线粒体异常、卵母细胞质量下降 ［ 13 , 14 ］ 。1. PCOS内分泌和代谢特征对卵母细胞线粒体的影响：典型PCOS患者的高雄激素水平会影响卵母细胞线粒体的功能。研究表明，用雄激素前体——脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）诱导的PCOS模型小鼠，其卵母细胞中线粒体DNA和ATP含量下降、线粒体膜电位降低，可能的机制包括DHEA直接作用于OXPHOS复合物Ⅰ抑制线粒体呼吸，或诱导卵巢中脂质、晚期糖基化终末产物及其前体甲基乙二醛累积，引发氧化应激和糖化应激等 ［ 15 , 16 ］ ，进而影响卵母细胞的受精能力 ［ 17 ］ 。高雄激素水平会促进脂肪细胞中脂质累积，引发体内脂代谢的紊乱 ［ 18 ］ 。PCOS患者血脂水平和卵泡液脂质水平偏高，可造成卵母细胞发育的高脂环境，影响卵母细胞及相关细胞的脂吸收、代谢及外排过程，从而引发细胞内脂质大量堆积 ［ 19 ］ ，进而产生脂毒性导致线粒体等细胞器受损。研究表明，脂代谢紊乱小鼠的卵母细胞中可观察到脂滴体积增加，线粒体的超微结构和亚细胞定位异常、膜电位改变，卵母细胞体外发育能力显著下降 ［ 19 , 20 , 21 ］ 。正常情况下，结构和功能异常的线粒体会被特异性地降解（即线粒体自噬）或修复，从而保证细胞内线粒体的质量，维持细胞正常的活性和功能。而Boudoures等 ［ 22 ］ 的研究表明，当体内脂质水平异常时，小鼠的卵母细胞在应对线粒体损伤时不会激活线粒体自噬，功能异常的线粒体会持续存留在卵母细胞中，阻碍卵母细胞正常的代谢活动。2. PCOS内分泌和代谢特征对颗粒细胞、卵丘细胞线粒体的影响：DHEA水平升高使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性降低，有可能引起卵丘细胞中磷酸戊糖途径下调、糖酵解途径上调；另外，卵丘细胞内其他代谢通路如脂肪酸β-氧化及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸分解代谢等同样也可发生变化，引起卵泡液的中间代谢物水平异常，在表观遗传修饰和翻译后修饰的层面导致线粒体结构异常、膜电位下降、生物合成减少、核周线粒体分布减少和线粒体自噬失调 ［ 23 ］ 。除代谢途径外，信号通路表达的改变也会引发细胞内线粒体的异常。高雄激素水平可能通过抑制PCOS患者颗粒细胞的丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路，下调过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC1α）基因和核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1）基因的表达，抑制线粒体生物合成（mitochondria biogenesis；指细胞内的线粒体数量和质量增加） ［ 24 , 25 ］ 。Pang等 ［ 26 ］ 用双氢睾酮诱导人卵巢颗粒细胞KGN后发现，细胞中沉默信息调节因子3（sirtuin 3）表达下调，叉头框蛋白O1-PGC1α信号通路受到抑制，从而导致线粒体功能障碍、线粒体DNA含量下降、氧化应激增强。有调查发现，高达70%的PCOS患者存在脂代谢紊乱、血脂异常的表型 ［ 27 ］ ，而暴露于高水平的脂肪酸，颗粒细胞的能量代谢功能会受到影响 ［ 28 ］ 。Marei等 ［ 29 ］ 应用蛋白质组学分析的方法研究在病理水平的棕榈酸下体外成熟的牛卵丘细胞的细胞反应，结果发现，线粒体OXPHOS复合物的部分亚基表达下调，OXPHOS反应和ATP合成的效率下降；此外，线粒体接触位点和嵴组织系统（mitochondrial contact site and cristae organizing system，MICOS）的亚基CHCHD3和线粒体内膜蛋白（inner membrane mitochondrial protein，IMMT）的表达量也明显减少。MICOS系统对于线粒体嵴结构的形成和维持至关重要，并在线粒体融合过程中参与同其他线粒体外膜接触的位点的形成 ［ 30 , 31 ］ ，这可能是PCOS患者脂代谢紊乱导致线粒体超微结构异常的原因之一。3. PCOS内分泌和代谢特征对卵泡膜细胞线粒体的影响：卵泡膜细胞是由卵巢间质细胞分化而来的内分泌细胞，是PCOS患者体内雄激素水平过高的主要来源 ［ 32 ］ 。Kobayashi等 ［ 33 ］ 在研究PCOS患者卵泡膜细胞线粒体自噬时，发现用高水平的棕榈酸（模拟PCOS脂代谢紊乱的内环境）处理牛卵泡膜细胞后，细胞内线粒体等细胞器自噬被抑制，线粒体形态、功能异常，氧化应激增强。（二）PCOS患者线粒体基因特征对卵泡细胞线粒体的影响线粒体是半自主性细胞器，其基因组包括37个关键基因，编码2种rRNA（12S和16S rRNA）、22种tRNA和OXPHOS复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的部分蛋白亚基 ［ 7 ］ ，因此可以相对独立地表达线粒体的部分蛋白质。有研究发现，PCOS患者线粒体基因组的编码区和非编码区中均存在变异，包括OXPHOS基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因、tRNA基因和D环（D-loop）区 ［ 7 ］ 。由于rRNA和tRNA在线粒体蛋白质合成的翻译步骤中起着关键作用，因此发生在12S rRNA基因、16S rRNA基因、tRNA基因及OXPHOS基因的突变均可能导致其编码的蛋白质结构和功能异常，引发卵泡细胞线粒体呼吸链功能障碍。例如，OXPHOS基因突变会在一定程度上直接影响OXPHOS复合物的功能，阻碍卵泡细胞线粒体OXPHOS的正常过程 ［ 9 ］ ；而tRNA Gln T4395C和tRNA Leu A3302G突变会影响tRNA分子受体臂的结构，可能会破坏氨基酸与tRNA结合的能力，从而影响多肽链的组装，同样可引发卵泡细胞线粒体功能障碍 ［ 34 , 35 ］ 。线粒体基因组的D-loop区发挥着调控线粒体DNA复制和转录的作用，而在PCOS患者线粒体D-Loop区中，有利于线粒体DNA正常进行复制和转录的多态性出现频率更低［ 36 ］ 。此外，Jia等 ［ 3 ］ 在研究PCOS线粒体基因表观遗传变异时，发现具有多囊特征的雌性猪的卵母细胞线粒体基因组中，编码OXPHOS复合物Ⅰ亚基的ND4基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因和D-loop区的甲基化程度明显升高，这提示，卵母细胞线粒体基因表达受抑制、线粒体活性下降。二、PCOS患者卵泡细胞线粒体异常导致卵母细胞成熟障碍的机制未成熟卵母细胞的能量主要来源于卵丘细胞内的线粒体，卵丘细胞借助缝隙连接与卵母细胞接触，通过代谢产物和调节分子的交换对卵母细胞的新陈代谢、减数分裂停滞和恢复以及细胞骨架重排等过程起支持作用 ［ 37 ］ 。随着卵母细胞的成熟，卵母细胞自身的线粒体数量迅速增加，成为其能量的主要来源 ［ 38 ］ 。除供能外，线粒体还在卵母细胞减数分裂、预备受精等过程中发挥着不同的作用。Duan等 ［ 39 ］ 的研究表明，线粒体动态分布有助于减数分裂时卵母细胞的纺锤体迁移至正确的空间位置；此外，受精前卵母细胞中高度极化的线粒体主要集中在细胞外周区域，线粒体DNA的数目也呈指数级增长，这可能与受精时精子成功钻入卵细胞密切相关 ［ 40 ］ 。由此可见，线粒体正常的数量、形态结构及功能对卵母细胞成熟具有十分重要的意义 ［ 41 ］ 。反之，PCOS患者的线粒体异常会引发卵母细胞能量供应障碍、氧化应激以及颗粒细胞过度凋亡，这与PCOS患者卵母细胞成熟障碍、卵母细胞质量下降有密切关系。1. 线粒体异常与能量代谢：线粒体是细胞有氧呼吸生成ATP的主要场所，线粒体异常引发的细胞能量供应障碍会影响卵母细胞成熟过程中的一系列细胞活动。具体而言，减数分裂过程中细胞骨架组装和染色体运动需要大量ATP供能，而PCOS患者卵母细胞中线粒体受损会导致细胞内ATP含量降低，减数分裂纺锤体形态异常，染色体排列和分离紊乱，产生非整倍体卵母细胞的概率增加。未成熟的卵母细胞自身利用葡萄糖的能力较弱，需要依赖颗粒细胞提供能量，因此，颗粒细胞线粒体能量代谢异常同样会影响卵母细胞的质量。研究表明，PCOS患者颗粒细胞的线粒体生物合成率、线粒体DNA含量和膜电位均显著低于正常人，这可能是导致其卵母细胞质量下降的重要原因之一 ［ 23 , 24 ］ 。2. 线粒体异常与氧化应激：线粒体既是ROS的主要来源，也是ROS的攻击靶点之一。PCOS患者卵母细胞中线粒体功能障碍会导致ROS的产生和清除失衡，从而诱发氧化应激，严重影响卵母细胞的质量和发育能力。过量的ROS会氧化DNA、RNA和蛋白质，破坏细胞膜的完整性，也会影响卵母细胞纺锤体的稳定性、染色体结构及端粒的长度 ［ 42 ］ 。研究表明，卵母细胞内过量的ROS不利于减数分裂过程的正常进行，而在体外成熟的卵母细胞模型中，加入抗氧化剂二甲双胍和褪黑素能通过缓解线粒体功能障碍、减少氧化应激而改善纺锤体组装和染色体排列 ［ 43 , 44 ］ 。另一方面，氧化应激可以通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、内质网应激-未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）以及蛋白激酶C δ（protein kinase C δ，PKC δ）-c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）1等信号通路，过度激活颗粒细胞和卵母细胞的线粒体等细胞器自噬，诱导细胞自噬性死亡 ［ 45 ］ 。同时，PCOS患者卵母细胞中高水平的ROS可以抑制沉默信息调节因子1（sirtuin 1）的表达，从而下调sirtuin 1-FOXO3-超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）通路，进一步增强氧化应激；ROS对线粒体DNA的攻击还会加重线粒体功能障碍，形成恶性循环 ［ 46 ］ 。此外，PCOS患者的卵泡膜细胞中过量的ROS会激活p38和JNK信号通路使细胞色素P450酶17A1 mRNA表达上调，从而促进卵泡膜细胞分泌雄激素 ［ 33 ］ ，使卵母细胞所处的代谢微环境进一步恶化。3. 线粒体异常与颗粒细胞凋亡：线粒体在细胞凋亡的内源性通路中起着关键作用。研究发现，PCOS患者颗粒细胞的线粒体膜电位明显下降，同时颗粒细胞凋亡率显著上升 ［ 47 ］ ；而Burke ［ 48 ］ 从生物物理学角度阐明细胞凋亡信号除氧化应激和UPR外，还包括线粒体OXPHOS效率低下、膜电位改变等；这些提示，线粒体异常可能是PCOS患者颗粒细胞凋亡增加的原因之一。考虑到颗粒细胞在卵母细胞新陈代谢、减数分裂停滞和恢复以及细胞骨架重排的过程中起到的重要作用 ［ 37 ］ ，PCOS患者颗粒细胞线粒体异常、继而引发细胞过度凋亡的现象可能是导致卵母细胞成熟障碍的又一原因。既往评估卵母细胞质量的主要方法是基于形态学特征（如：极体不规则或不完整、透明带过厚及卵周间隙过大预示着卵母细胞质量较差）［ 49 ］ ，但此标准具有一定的主观性和局限性。线粒体相关指标作为备选指标，能够从另一角度客观评价卵母细胞和胚胎质量。与体细胞不同，卵母细胞的线粒体含1~2份DNA拷贝 ［ 50 , 51 ］ ，故卵母细胞线粒体DNA和ATP的含量以及线粒体的分布可作为衡量其发育能力的预测指标，但是该方法的缺陷在于具有侵入性，不适于用作临床实践中的预测工具。细胞中的代谢辅酶如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）等的相对含量可以反映细胞内线粒体OXPHOS反应的活跃度，同时能够在一定条件激发下发出荧光。Tan等 ［ 52 ］ 用该方法对小鼠卵丘细胞-卵母细胞复合体进行自发荧光成像评估，用光学氧化还原比率，即：FAD荧光强度/［NAD（P）H+FAD］荧光强度，有效区分了正常卵母细胞与低发育潜能的卵母细胞；同时通过对比进行成像和未进行成像的卵母细胞的受精率、妊娠率和活产率等指标表明了该方法的安全性；这提示，自发荧光成像可作为一种预测卵母细胞质量的无创性方法应用于临床。此外，由于颗粒细胞获取相对容易，且可间接反映卵母细胞质量，针对卵巢颗粒细胞的研究可以作为预测卵母细胞质量和胚胎发育潜力的又一无创性方法。Anderson等 ［ 51 ］ 针对28~42岁妇女的前瞻性队列研究发现，>35岁妇女的卵丘细胞线粒体膜电位较≤35岁者更高（即耗氧量高而产能效率低）；Lan等 ［ 53 ］ 的研究表明，卵丘颗粒细胞（cumulus granulosa cell）中线粒体DNA拷贝数与卵母细胞成熟度密切相关；而Boucret等 ［ 54 ］ 发现，卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve）的患者卵母细胞质量下降的原因包括颗粒细胞线粒体生物合成异常，这提示，检测颗粒细胞的线粒体膜电位、线粒体DNA拷贝数及线粒体生物合成率可以作为体外受精过程预测卵母细胞质量的指标。在常规治疗方法效果不佳的情况下，PCOS患者可以选择辅助生殖技术进行体外受精-胚胎移植，但由于患者内分泌代谢特征和线粒体基因特征会对卵母细胞成熟过程造成不良影响，其辅助生殖治疗结局往往较差 ［ 13 ］ 。目前，评估形态学特征仍然是预测PCOS患者卵母细胞质量的主要方法，考虑到PCOS患者线粒体数量、结构和功能异常与其卵母细胞质量下降的密切关系，上述用于评估卵母细胞质量的线粒体相关无创性指标在临床实践中可能存在一定的应用前景，有利于更准确地选择合适的卵母细胞和胚胎，提高辅助生殖治疗的成功率。综上，线粒体在卵母细胞成熟过程中发挥着代谢产能、控制ROS水平、调节细胞凋亡等重要作用。在PCOS患者体内代谢水平紊乱以及线粒体基因存在异常遗传变异的情况下，卵泡细胞线粒体的数量、结构和功能会在一定程度上出现异常，从而直接或间接影响卵母细胞的质量及发育潜能，减低患者的生育力。针对这一特点，临床上可以通过分析卵母细胞内代谢辅酶的荧光影像、测量卵丘颗粒细胞线粒体DNA拷贝数、线粒体膜电位等指标，对PCOS患者的卵母细胞质量进行评估，从而预测辅助生殖治疗结局。对线粒体异常在PCOS患者卵泡发育异常中的作用进行深入研究，有利于进一步揭示PCOS患者生育力下降的机制，并且可能从多个角度为改善PCOS患者卵母细胞质量提供新的理论依据和治疗方法。
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