如何从脾脏中获取B淋巴细胞?
材料准备:选取具有正常免疫功能的成年小鼠(通常一只小鼠脾脏可提取的淋巴细胞数量为2~6×107),快速断颈处死(避免脾梗死,脾动脉及其分支的阻塞,造成局部组织的缺血坏死称为脾梗死)后,浸泡于75%酒精中;准备好已消毒的眼科剪、眼科镊,以及一个装有一定量PBS(一种缓冲液,维持pH和离子浓度的稳定)的无菌皿,分离脾脏后置于皿中,全程无菌操作。
小鼠脾脏处理:脾脏细胞数量较少时,可用两个1mL无菌注射器的针尖将脾脏戳出大量的空洞后,轻轻刮取脾脏表面,将脾脏细胞刮出;数量较多时,可用注射器活塞和细胞滤网进行研磨后离心(并不是我们平时用研磨棒提取细胞内酶的研磨方法,如图所示),也可得到淋巴细胞。
离心:15mL离心管中吸入5mL ficoll分离液(一种淋巴细胞的分离液),倾斜管身,小心吸取含淋巴细胞的PBS缓慢加入ficoll分离液,可见明显液体分层。600rpm梯度离心25分钟。如图所示(其中胎牛血清层可以用其他培养液代替):
二次离心:得到分为3层的液体, 小心吸取中间层液体(含淋巴细胞+红细胞)并置于新的15mL离心管,补满PBS,600rpm离心5分钟。底层是红细胞可以用血液静置后的分层来理解,密度和大小决定分布在底层。
三次离心:弃上清PBS, 可见黑红色沉淀,加入1~2mL红细胞裂解液(原理是红细胞比淋巴细胞更易吸收裂解液中的离子,细胞内渗透压增大,红细胞吸水胀破),冰上裂解5分钟,补满PBS, 600rpm离心5分钟。
获取淋巴细胞:弃上清PBS, 可见白色沉淀,此为总淋巴细胞。
2.操作过程中的注意事项
(1)所有操作均以无菌试剂、耗材,无菌环境内操作为前提。
(2)由于整个过程需要淋巴细胞长时间处于体外PBS中,所以对PBS的要求比较严格;为保护淋巴细胞,也可以使用专门的淋巴细胞缓冲液。
(3)若小鼠饲养时间较长,或者小鼠脾脏异常肿大,导致研磨后细胞悬液呈现暗红色时,须将细胞悬液 用小鼠分离液等体积稀释并混匀后,再进行离心操作。
(4)分离液易挥发,每个脾脏的研磨时间应控制在 5min 以内。
(5)分离液开封后,请尽量保存在 2℃-8℃环境,避免因液体挥发造成分离液密度变化,影响分离效果。
(6)推荐使用注射器活塞来研磨脾脏,活塞比较钝不易损伤细胞。推荐使用尼龙网,因为尼龙网更柔韧。利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度, 将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。控制研磨力度,使尼龙网保持悬空,避免在皿底上直接 研磨而造成大批细胞死亡。培养皿的口径不能太大,否则尼龙网不能产生有效的弹力。镊子在一边夹住尼龙网,防止尼龙网在研磨过程中滑动。
试题:(2020年全国高考试题)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。
回答下列问题:
(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是 。
(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤: 。
(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于 ,使用该培养基进行细胞培养的结果是 。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是 。
(4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有 (答出2点即可)。
答案:(1)诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞 (2)取小鼠甲脾脏剪碎,用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞,加入培养液制成单细胞悬液 (3)选择培养基;只有杂交瘤细胞能够生存;抗原与抗体的反应具有特异性 (4)将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养
解析:(1)实验前给小鼠甲注射病毒A,是为了诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。(2)取小鼠的脾脏,剪碎组织,用胰蛋白酶处理获得单个细胞,加入培养液可以制成单细胞悬液。(3)图中筛选1需要用到选择培养基,只有杂交瘤细胞可以存活。筛选2是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞,该过程要用到抗原抗体杂交,筛选所依据的原理是抗原-抗体反应具有特异性。(4)获得能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞后,可以在体外培养液中进行培养,或在小鼠的腹腔中进行培养,使杂交瘤细胞大量增殖。
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