我们要必须知道，MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。MSP 的引物设计与普通的PCR引物设计不同。
MSP 的引物设计原理是：模板DNA在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点 5'-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5'-端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C-U。针对修饰前后的序列差异用 MethPrimer 软件设计甲基化与未甲基化引物，进行 PCR 扩增。
MSP 的引物序列中至少含有 1 个以上 CpG 位点，最好是含有多个 CpG 位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高 DNA 启动子甲基化碱基的检出率。
MSP 的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的 DNA 序列设计，同时也应该尽可能与普通 PCR 的引物设计原则相符合。
按 MSP 的要求，任意 DNA 序列在做 MSP 扩增时，至少要合成 2 对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在 MSP 的未甲基化引物序列中正向引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初设计 MSP 者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到相应的 MSP 引物，可用在线 MethPrimer 软件在线设计引物。根据软件提示可以找到所需要的 MSP 引物。
但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其（C+G）含量相对较高，MSP 扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如 Primer 5.0 从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率小于 30% 的引物要进行优化，方法是在核心启动子区域前后反复调整甲基化正向引物打增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高 PCR 产量。
而亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的 pH 值及反应时间。
其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，具体如下：
① 亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3.0~3.9mol/L，其 pH 值必须用 NaOH 精确调整至 5.0；
② 修饰时间应掌握在10~16h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且 DNA 模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
③ 反应温度应控制在 50~55℃（若用国产恒温水浴箱建议温度设定在 53 ℃ 为好）；
④ DNA 模板量应控制在 <2 μg 为宜。
但是，MSP 的反应体系的成分与普通 PCR 一样 ，反应体系的优化也与普通 PCR 类似，反应体系的优化与普通 PCR 的反应体系中最大的区别是 DNA 模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP 的 DNA 模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求 A260/A280 在1.8~2.0 之间；含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因 DNA 模板加得太多而导致 DNA 处理不完全致使 MSP 扩增失败；而加的 DNA 模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致 MSP 假阴性。Mg+ 浓度一般在 2.0~2.5 mmol/L 为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR 的缓冲液及 Taq 酶的来源也很重要，一般的 PCR 缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的 Taq 酶也会影响结果的重复性。我们建议用 Takara 公司针对富含 CG 等复杂二级结构模板的 TaKaRa LATaq 和 GC 缓冲液效果较好。而一旦选用某一厂家 Taq 酶后，不要轻易更换，以免 MSP 因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
MSP 扩增结果时的 3 种情况：
① 产物电泳为阴性；
② 产物电泳出现多条非特异性条带（含目的基因条带）；
③ 产物电泳为阳性（仅目的基因条带）。
出现前 2 种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整 MSP 的反应温度而得到目的基因带。PCR 反应中，Tm 的高低与（C+G）含量呈正相关，因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现 PCR 偏性。
今天就介绍在这里，文章中的内容仅供参考，如果对您有所帮助还望点赞、转发+关注，我们下期不见不散！
要了解更多体外诊断研发技术、付费内容、配方、注册资料、行业报告、性能评估模板等，欢迎扫下面二维码加入“体外诊断IVD知识库-知识星球”进行免费咨询、不限次数提问和星友们一起成长吧！
