神经科学的一大核心问题是结构和功能的关系：在网络尺度上，即神经元网络的信息表征与网络结构的关系，在单细胞层面，即神经元的功能性活动与神经元结构变化的关系。然而，神经活动的快速毫秒级波动以及突触形态的亚衍射分辨率变化，给实验技术和数据分析带来了巨大的挑战。近日，Advanced Science 杂志发表两天题为：Graphene Microelectrode Arrays, 4D Structured Illumination Microscopy, and a Machine Learning Spike Sorting Algorithm Permit the Analysis of Ultrastructural Neuronal Changes During Neuronal Signaling in a Model of Niemann–Pick Disease Type C的研究，研究人员构建了一种融合了石墨烯微电极芯片、电生理、超分辨成像和人工智能的多技术融合方法进行多模态跨尺度检测神经元网络信号和神经元结构变化，为神经科学研究提供了新的视角和工具。研究神经元动态结构变化的一个主要挑战在于如何在单一实验体系中同时获得高时间分辨率的电生理数据和高空间分辨率的突触结构信息。传统的电生理记录方法，如微电极阵列（MEA），虽然能够提供毫秒级的时间分辨率，但由于电极材料的光学不透明性，限制了与光学显微成像的兼容性。此外，普通光学显微镜的分辨率受限于衍射极限，难以解析亚衍射尺度的突触结构变化。因此，传统记录系统无法实现高时间空间分辨率的神经元动态结构信息的记录。为了解决这些问题，本研究采用了特制的石墨烯微电极阵列（G-MEAs）。石墨烯具有优异的导电性和高度的光学透明性 （97.7%透射率），使其成为理想的透明电极材料，能够在不干扰光学成像的情况下实现高时间分辨率的电生理记录。通过将G-MEAs与4D结构光照明显微镜（SIM）相结合，实现了对神经元网络活动和突触超微结构变化的同步观测，能够解析亚衍射尺度的突触结构变化。结合时间维度的成像，4D SIM提供了对突触动态变化的全方位观测。此外，为了高效处理从MEA记录中获得的大规模数据，本研究开发了一种易于实施的机器学习（ML）算法，用于神经元尖峰信号的分类和分析。传统的尖峰分类方法需要大量的人工干预和计算资源，而该ML算法提高了数据处理的效率和准确性，使研究者能够从大量的电生理数据中快速提取有意义的神经活动信息。在模态方面，这一技术整合了电生理记录和钙离子成像记录，从活动和结构两个方面对神经元进行研究。在尺度方面，这一技术可以实现大规模神经元网络的钙离子、电信号活动记录到单突触结构变化。通过多模态跨尺度的神经元记录，克服了传统方法的局限性，通过同时获取神经网络的功能和结构信息，研究者能够更全面地理解神经元的活动模式和突触变化之间的关联，为探索神经系统的复杂机制提供了强有力的工具。图2：成熟海马神经元在G-MEA上的钙成像，左下角的缩放图由钙离子成像图和电极设计图叠加而成，显示了相应电极的位置。由于石墨烯的高度透明特性，故其无法在荧光成像中被观察到。
为验证这一技术的可靠性和实用性，本研究深入揭示了尼曼-皮克病C型（NPC）模型中神经元突触结构和功能的变化。NPC是一种罕见的神经退行性疾病，特征是细胞内胆固醇运输障碍，导致神经元功能受损和神经退行性变。通过在G-MEAs上培养原代海马神经元，并使用U18666A处理以模拟NPC的病理状态。利用这一多模态跨尺度神经元检测技术，研究人员发现了：1）神经信号传递能力的下降：对神经元网络的电生理记录显示，U18666A处理组神经元的尖峰放电频率和同步性下降，反映了整体神经网络活动的功能性损伤。与此同时，成像结果显示了神经元的凋亡，导致神经元网络结构节点的消失与结构变化。这种结构退化与电活动上的功能性退化同步发生，紧密相连，从两个维度揭示了NPC疾病模型在神经元网络层面的退化机制。2）突触的形态变化：此研究使用4D SIM成像，观察到处理组的突触体积显著增大，表明突触结构发生了显著的超微结构变化，并暗示了亚细胞结构内炎症的存在。而这一尺度的变化的出现早在神经元的凋亡和同步性的下降之前，无法通过传统宽场成像，这也说明了更早期的疾病表型需要更精密的技术来检测。图3：宽场成像和结构光成像对同一结构的成像结果图，此图为4维动态结构图的一个时间点的3维图像。黄色箭头标记同一个突触结构。比例尺：5微米。
这些发现揭示了NPC病理状态下，神经元突触结构变化与功能受损之间的关联，为理解NPC的发病机制提供了新的见解。更广泛地，这种方法学为研究其他神经退行性疾病中的突触功能失调提供了新的手段，有助于探索疾病的早期标志和潜在的治疗靶点。本研究提出的多技术融合方法具有广泛的应用潜力，有望能够在多个神经科学研究领域中发挥重要作用：首先在神经网络动力学的研究上，该方法可帮助揭示神经网络的动力学变化和突触可塑性的机制。而突触可塑性和神经网络活动的异常被认为是多种疾病的关键病理特征。该方法可用于研究这些疾病模型中的突触结构变化和神经网络功能紊乱，为理解疾病机制和开发新的治疗策略提供依据。比如，在自闭症谱系障碍和注意力缺陷多动障碍等神经发育疾病中，突触发育和功能的异常可能是核心因素。通过同步观测神经元的活动和突触发育过程，可深入探讨这些疾病的病因。另外，该方法提供了新的技术手段同时从结构和活动两方面评估药物对神经元功能和结构的影响，加速新药的开发和神经保护剂的筛选。综上所述，本研究通过构建石墨烯微电极阵列、4D结构光照明显微镜和机器学习算法，构建了一整套多模态跨尺度的神经元网络动态结构的检测和解析方法，实现了对神经网络活动和突触超微结构变化的同步、高分辨率观测，为深入理解神经元功能和疾病机制提供了强有力的工具。这种多技术融合的方法学，不仅在研究尼曼-皮克病C型等神经退行性疾病中展示了巨大的潜力，而且在更广泛的神经科学研究领域中具有重要的应用价值。未来，通过进一步的优化和扩展，该方法有望为神经科学的基础研究和临床应用带来新的技术支持，推动我们对大脑功能和疾病的理解。本项研究由剑桥大学Gabriele S Kaminski Schierle教授的分子神经实验室（Molecular Neuroscience Group）领导进行，卢萌博士（已于2024年入职北京大学临床医学高等研究院）为文章的第一作者。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202402967博士后招聘请见：
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