microRNA（miRNA）是一种长度约为19-25nt单链RNA，一般参与转录后调节基因表达。作为非编码RNA（ncRNA），目前大量的研究显示一些差异表达miRNA在众多的疾病中扮演者重要的角色，而了解miRNA差异表达，荧光定量PCR是最基础、应用最广的检测和定量miRNA的方法。
由于miRNA的长度比较短，因此传统的荧光定量并不适用，下面介绍的两种方法的最根本的原理其实就是延长miRNA。因此在这里分享了关于miRNA进行qPCR的两种方法和一些经验总结：
一、提取细胞、血清或外泌体RNA
就目前而言，针对不同样品TRIZOL法提取RNA是比较通用的提取RNA的试剂，但是也具有相应的提取试剂盒（血清RNA提取试剂盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA进行后续实验，但有文献说明TRIZOL法可能会导致miRNA丢失，也可选择miRNA提取试剂盒。TRIZOL法之前有分享过详细的步骤，这里就不在详细阐述了。
二、miRNA的qPCR
1. miRNA茎环法逆转录+miRNA荧光定量PCR
原理：在逆转录过程中我们需要设计一个茎环引物与我们miRNA序列结合起到延长miRNA的作用。而茎环引物是一个长度约为45bp且能够自身环化的引物。每一个miRNA都具有自己特异的茎环引物，这最重要的原因就是设计的茎环引物中包含一段与miRNA互补序列有关：茎环逆转录引物=5’端的茎环序列+3’端的miRNA的特定互补序列。
①茎环引物的设计：
5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，红色部分的序列可形成自身环化。
另外，针对特定miRNA设计的茎环引物：只需要在通用茎环引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更换成T后的序列3’端开始数6-8个碱基（一般选择6个）的反向互补序列加在茎环通用序列的3’端即可，这样就得到某个miRNA的茎环引物。
以hsa-miR-30b-5p为例，其成熟序列为UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部换成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；则其茎环引物为：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′
②逆转录（RT）：去除基因组DNA+逆转录（可使用miRNA专用的茎环法逆转录试剂盒）
1)去基因组DNA（2ul 基因组去除试剂）；
2)RNA体积：根据提取RNA浓度来定+free-RNase H2O(to 10 ul)；
3)吹打混匀，42℃反应2min
4)逆转录：1ul茎环引物（stem-loop）+试剂盒中逆转录MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)
5)一般来说，一次逆转录只能进行一个miRNA的单独逆转录，但是根据实际情况而言，我们可以将miRNA+内参U6混合在一管中一同逆转成cDNA。
根据以上试剂盒设计的加样量，我尝试过一管内混合逆转录内参+5个miRNA，其中主要的变化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加茎环引物时，我们可以将所加入的free-RNase H2O（5ul）替换成不同的茎环引物(5个)，这种方式在特异性的基础上又比较高效的合成多个miRNA，虽然节省试剂，但是也存在弊端，例如我们加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入过多的茎环引物合成最终的各种miRNA的cDNA产物可能存在浓度过低，混合不匀可能会影响后续的荧光定量。
③荧光定量（qPCR）
5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，则通用反向引物为：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′
2)荧光定量：10ul体系（20ul体系减半）(SYBR染料法)：
5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）
例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差异表达水平，以U6为内参：
对照组+处理组：此时为了减小误差bar的大小做4个复孔，以八联管为例：
④上机操作：以BIO-RAD为例：
(1)电脑上：点开桌面程序，点击User-defined
(2)设计Protocal，点击Create NEW
(3)定义plate:点击Create NEW
(4)染料法选择SYBR
(5)选择unknow
(6)选择样本孔（well），点击SYBR，定义样本
(7)检查程序，打开仪器盖子，放置八联管，关闭盖子，点击“start run”
2. miRNA加尾法逆转录+通用荧光定量PCR
①逆转录（RT）:
将提取的RNA按照试剂盒的体系配置好，该步骤我们只需提供RNA，其余逆转录引物、逆转录酶以及dNTPs包含在Mix中。一管内即可逆转录多个miRNA的cDNA。
②荧光定量（qPCR）:使用通用荧光定量试剂盒
加尾法的上游引物（正向引物）设计：
例如hsa-miR-30b-5p的成熟序列为UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部换成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT即为加尾法的正向引物；
加尾法的qPCR反应体系跟普通的qPCR体系一样，程序也类似。但是如果一次做许多的miRNA，在一次qPCR反应后可以观察熔解曲线看该引物特异性是否较好，也可通过优化下退火温度，改善正向引物。
三、经验分享
（1）茎环法：对于每个miRNA都会设计特异的逆转录引物并进行单个miRNA的单独逆转录；另外，也会设计特异的qPCR特异正向引物。因此推荐是每个miRNA都单独逆转录，特异性比加尾法高，但是一次只能测一种miRNA。然而尝试过一管逆转录5个miRNA+U6，但对于后期qPCR的结果熔解曲线显示特异性良好，但是个别复孔的Cq偏低，可能是cDNA并未混匀的原因。因此，茎环法对于适用于研究1-2两个miRNA，特异性较好。
引物特异性较好，单峰比较尖锐
（2）加尾法：该方法的试剂盒可对所有的miRNA都进行polyA加尾，同时用通用的逆转录引物，把所有的miRNA都逆转录，逆转录的产物就可以分别用于各个miRNA的qPCR的反应，因此，我们只需一次逆转录样品即可。方法比较高效，但是可能造成较差的特异性。加尾法适用于多个miRNA (3个以上)的研究，即大量miRNA前期的筛选，因为一次逆转录可以进行多个miRNA的qPCR扩增，更加方便。
引物特异性较差，出现双峰，可能存在引物二聚体
（3）两种方法结合使用，在试剂有限且要分析大量miRNA的基础上，我们可以筛选出引物特异性不好的miRNA继续使用茎环法，而正向引物特异性较好的仍然使用加尾法，在筛选出固定miRNA进行具体分析时，我们仍可以沿用茎环法。
本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：
https://en.wikipedia.org/wiki/MicroRNA
https://images.app.goo.gl/yFDuhS7opSDMtWVE7
往期文章推荐
手把手教学——荧光定量PCR全流程实验步骤和注意事项
引物设计与验证的注意事项
手把手教学——原位杂交实验流程
