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第一作者：崔影超
通讯作者：高景峰
通讯单位：北京工业大学
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.150656
图文摘要
成果简介
近日，北京工业大学高景峰课题组在环境领域学术期刊Chemical Engineering Journal上发表了题为“Identification of acetaminophen degrading microorganisms in mixed microbial communities using 13C-DNA stable isotope probing”的学术论文。该论文首次应用13C-DNA稳定同位素核酸探针（DNA-SIP）技术，从实验室规模硝化系统中收集的三种混合微生物群落中鉴定了参与对乙酰氨基酚（APAP）代谢的微生物。基于DNA-SIP，确定了絮体污泥、好氧颗粒污泥和生物膜反应器中APAP的关键降解菌分别为Achromobacter、Aliicycliphilus和Thauera，相对丰度分别为43.20%、10.12%和12.60%。此外，首次发现Leucobacter、Achromobacter、Aliicycliphilus、Thauera、Microbacterium和Lactobacillus对APAP的生物降解有直接作用。然而，Achromobacter、Lactobacillus和Aliicycliphilus与传播抗性基因（intI1、sul2、qacEdta1-02和qacH-01）有关。结果表明，Acinetobacter、Leucobacter、Thauera和Microbacterium可作为处理APAP废水的生物强化菌株。最终，本研究结果可以丰富微生物降解APAP的现有知识，并加速生物强化工艺的实施，以实现APAP的有效去除。
引言
对乙酰氨基酚（APAP，C8H9NO2）是国际上公认应用最广泛的治疗发热和疼痛的药物之一。APAP在体内几乎不被吸收，以代谢和自然形式排出体外，在污水、地下水和地表水中广泛存在。APAP对水生生物和人类都有毒性，可引起细胞内脂质氧化降解、遗传密码损伤和蛋白质变性。为了防止APAP在环境中的积累，APAP的有效降解值得研究。生物降解是一种低成本和环境友好的降解APAP的方法。DNA稳定同位素核酸探针（DNA-SIP）技术通常用于鉴定负责某些特定代谢过程的功能微生物，这些微生物可以直接将相应的13C标记的底物同化到其生物体中，其关键优势是能够鉴定不可实验室培养的目标微生物。利用DNA-SIP技术鉴定硝化过程中活性APAP降解菌的研究尚未见报道。
图文导读
絮体污泥（FS）、好氧颗粒污泥（GS）和生物膜（BF）硝化系统中APAP降解菌的鉴定
超速离心后各组分中DNA的浓度如图1（a）所示。重层DNA样品由浮力密度范围为1.74-1.77的DNA组成，轻层DNA样品由浮力密度范围为1.69-1.72的DNA组成。如图1（b）所示，絮体污泥系统中的APAP降解菌为Achromobacter、Acinetobacter和Leucobacter，它们在FH13中相对丰度均超过1.0%，富集比均大于2.08；其中Achromobacter丰度最高为43.20%，是絮体污泥系统中主要的APAP降解菌。好氧颗粒污泥系统中，只有Aliicycliphilus的相对丰度均超过1.0%（10.12%）且富集比大于2.0（124.86），被鉴定为APAP降解菌。生物膜系统中，Thauera、Microbacterium、Leucobacter、Lactobacillus和Aliicycliphilus的相对丰度分别为12.60%、3.32%、2.33%、1.37%和1.12%，均超过1.0%；并且富集比均超过3.45，被鉴定为生物膜系统中APAP降解菌;其中，Thauera相对丰度最高，富集比为35.19，是生物膜系统中关键的APAP降解菌。本研究除了已知的APAP降解菌（Acinetobacter和Pseudomonas）外，首次发现Leucobacter、Achromobacter、Aliicycliphilus、Thauera、Microbacterium和Lactobacillus直接负责硝化污泥中APAP的生物降解，这为APAP降解菌的多样性提供了更深入的认识。
图1 三种污泥经微宇宙培养的DNA超离分层后各组分中的浓度（a）；不同系统中根据富集比鉴定出的APAP降解菌（b）。FS：絮体污泥；GS：好氧颗粒污泥；BF：生物膜。
APAP降解菌与ARGs的关系及其代谢途径分析
图2（a-c）显示，絮体污泥系统中Achromobacter与sul2呈显著正相关，表明其可能具有抗磺胺类药物的能力；好氧颗粒污泥系统中的APAP降解菌与ARGs之间没有明显的相关性，表明好氧颗粒污泥系统中APAP降解菌传播ARGs的风险较小；生物膜系统中Lactobacillus与intI1和sul2呈显著正相关；Alicycliphilus与intI1呈显著相关，表明Lactobacillus和Alicycliphilus均具有通过HGT传播ARGs的能力。综上所述，Acinetobacter、Leucobacter、Thauera和Microbacterium传播ARGs的风险低于Achromobacter、Lactobacillus和Alicycliphilus，可以作为APAP污染废水处理生物强化菌株的候选者。
图2（d-f）显示在所有样本中，KEGG通路等级1的主要功能类别是代谢、遗传信息处理和环境信息处理。其中，代谢是主要类别，相对丰度为49.29 ~ 58.98%，说明这些系统中的微生物可以将APAP作为唯一的碳源和能量进行代谢。在絮体污泥系统中，13C重层DNA中富集了细菌分泌系统（5.71%）、ABC转运体（18.55%）、双组分系统（8.19%）、丁酸盐代谢（3.62%）、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢（3.34%）和丙酮酸盐代谢（3.85%）（等级3），高于13C轻层DNA和12C重层DNA。在好氧颗粒污泥系统中，13C重层DNA富集了缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（2.97%）、丁酸代谢（3.11%）和丙酮酸代谢（3.80%）（等级3）。在生物膜系统中，13C重层DNA富集了嘌呤代谢（5.82%）、氧化磷酸化（4.21%）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（3.34%）、丁酸代谢（3.74%）和丙酮酸代谢（4.02%）（等级3）。结果表明，嘌呤代谢、氧化磷酸化、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丁酸代谢和丙酮酸代谢可能是APAP的主要代谢途径。相关代谢酶分析表明三个体系的重层DNA样品中都富集了乙酰CoA酰基转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶，并选其为代表性受体，利用分子对接模拟分析APAP与代谢酶的相互作用力和结合区位点。图3表明，Val-217和Lys-220是乙酰CoA酰基转移酶与APAP之间形成氢键的关键结合位点，结合能为-6.1 kcal/mol；Gys-41和Gyl-13是二氢硫辛酰胺脱氢酶与APAP之间形成氢键的关键结合位点，结合能为-6.2 kcal/mol；说明APAP对乙酰CoA酰基转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶均具有较强的亲和力。
图2 APAP降解菌与不同ARGs的相关性分析（a）；基于KEGG数据库分析预的微生物功能代谢（b）
小结
本研究首次利用DNA-SIP技术鉴定三个硝化系统中APAP降解菌。絮体污泥、好氧颗粒污泥和生物膜系统中APAP的关键降解菌分别为无色杆菌属（Achromobacter）、脱氮嗜脂环物菌属（Alicycliphilus）和陶厄氏菌属（Thauera），相对丰度分别为43.20%、10.12%和12.60%，对APAP的降解起着重要作用。KEGG代谢途径阐明了嘌呤代谢、氧化磷酸化、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丁酸代谢和丙酮酸代谢可能是APAP的主要代谢途径。此外，在所有重层DNA样品中都富集了乙酰CoA酰基转移酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶，它们分别通过Val-217、Lys-220和Gys-41、Gyl-13结合位点与APAP相互作用。网络分析结果显示，Acinetobacter、Leucobacter、Thauera和Microbacterium传播ARGs的风险较Achromobacter、Lactobacillus和Alicycliphilus低。本研究可为深入了解原位APAP降解菌的多样性提供理论依据。
该项目得到了北京市自然科学基金（24JL004）和国家自然科学基金（52170016）资助。
主要作者介绍
高景峰：教授、博士生导师，现任职于北京工业大学环境科学与工程学院。主要研究领域为污水新型生物脱氮除磷技术、好氧颗粒污泥技术、新污染物控制技术等。入选北京市科技新星计划，主持5项国家自然科学基金、5项北京市自然科学基金、1项国家科技重大专项课题子任务、1项北京科委科技计划项目。以第一作者或通讯作者身份发表SCI论文100余篇，授权中国国家发明专利30余项。2021年入围全球顶尖前10万科学家名单。联系方式：gao.jingfeng@bjut.edu.cn。
崔影超：北京工业大学环境工程专业在读博士研究生。主要研究方向为新型生物脱氮技术。目前以第一作者在杂志Water Research、Chemical Engineering Journal、Bioresource Technology、Environmental Research发表SCI论文共7篇，授权1项国家发明专利。
来源：北京工业大学高景峰课题组
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编辑 | 尹顺昌、石钰婷
校对 | 刘俊、季斌、岳景雪
校核 | 崔影超、高景峰、韩昫身
