浙江工业大学李军团队Bioresource Technology：铁碳对絮体和好氧颗粒污泥氮代谢的作用

微生物多样性分析

IC丰富了污泥中的物种数量。Shannon和Simpson指数表明投加IC的反应器中污泥的微生物多样性更加丰富。按样本获取时间将样本分组进行PCoA分析发现微生物群落结构是同时变化（Fig. 2a），而颗粒化后的污泥随IC投加量与种子污泥的距离越远。颗粒与絮体各自成组，同一反应器中颗粒和絮体之间距离随IC投加量越近（Fig. 2b）。这说明IC使微生物群落结构发生变化，并且缩小了颗粒与絮体的微生物群落差异。对微生物表型预测发现IC提高了形成生物膜功能的相对占比（Fig. 2c），并且该功能在颗粒中占比高于絮体。

四个反应器中微生物在门水平上Bacteroidota、Chloroflexi、Planctomycetota、Proteobacteria均出现过大于10%的相对丰度（Fig. 2d）。污泥颗粒化后Thauera和norank_o__mle1-8相对丰度急剧减少，氨氧化细菌unclassified_f__Comamonadaceae和norank_f__NS9_marine_group成为优势属。Hyphomicrobium、Hydrogenophaga、SWB02、Immundisolibacter、Novosphingobium、norank_o__Dadabacteriales、norank_f__PHOS-HE36、norank_f__Caldilineaceae在所有颗粒化阶段的样本中的相对丰度均存在大于1%。颗粒和絮体之间的优势菌种完全相反（Fig. 2e），它们具有不同的硝化和反硝化优势菌群。Candidatus_Competibacter在四个反应器中的颗粒中丰度为16.8-28.5%，絮体中为1.8-8.4%。unclassified_f__Comamonadaceae在四个反应器中的颗粒中丰度为1.0-5.3%，絮体中为17.4-28.2%。这是样本中差异最显著的两个属，并且它们都具有氮代谢的性能。

图2. (a)造粒前后污泥的PCoA；(b)颗粒和絮凝体的PCoA；(c) BugBase表型预测；(d)在门水平上微生物群落的相对丰度；(e)颗粒组与絮体组差异的显著性检验(*p < 0.05表示差异显著)；(f)所有样品中属水平主要微生物的相对丰度(每个样品的相对丰度前10名)。

基因和代谢途径分析

_{通过宏基因组学分析氮代谢(ko00910)路径相关的基因变化（Fig. 3），并根据功能分类(模块)重绘了单元集。主要关注硝酸盐同化(M00615)；硝酸盐同化还原(M00531)；硝酸盐异化还原(M00530)；反硝化(M00529)；固氮(M00175)；完全硝化(M00804)。本研究中与这些模块相关的基因共检测出36种，KEGG 同源基因(KO)编号和基因描述见Table S6。IC对参与氮代谢的基因的影响不完全是相同趋势（Fig. 3a）}。

氨氧化菌通过AMO将氨氧化成羟胺(NH₂OH)而激活氨，再通过HAO将NH₂OH氧化成亚硝酸盐。污泥颗粒化后基因amoA/B/C和hao明显提高，但IC的作用在四个SBR中差异性不大。亚硝酸盐在NXR的作用下氧化，这是产生硝酸盐的主要生化途径。AGS系统中颗粒的nxrA/B明显增加，并且IC投加量与NXR呈正相关。

按照产物的去向，硝酸盐还原分为硝酸盐同化还原和硝酸异化还原。硝酸盐同化还原由硝酸转运蛋白（NRT）将硝酸盐转运到细胞内，总体上IC促进了该过程，使硝酸盐更多的进入细胞进行下一阶段（Fig. 3b）。硝酸盐在同化性硝酸还原酶（NAS）和NAR共同作用下转化为亚硝酸盐。IC抑制了narB，而促进了nasA/B。参与NAS合成的基因丰度远高于NAR（4-13倍），这说明在M00531中硝酸盐更多的是被NAS转化为亚硝酸盐。硝酸盐异化还原不以合成细胞物质为目的，根据产物不同分为硝酸盐异化还原到氨和反硝化。硝酸盐还原为亚硝酸盐在M00530和M00529中共用基因组，由参与NAR和NAP的基因控制。NAP是好氧反硝化酶，可以在有氧条件下进行反硝化。AGS系统中napA/B仅在R30和R10中增加相比于R0，并且絮体中明显多于颗粒。絮体中好氧反硝化的基因被提高，但反硝化中控制厌氧反硝化酶合成的基因（narG/H/I/V/Y/Z）依然占主导地位。显然，颗粒中NAR远多于絮体，并且IC在颗粒中对NAR的增加比絮体明显。

亚硝酸盐在NIR催化下还原，M00531(nirA)、M00530(nirB/D)、M00529(nirK/S)中参与NIR合成的基因组成不同导致产物不同。反硝化中亚硝酸盐还原为NO，从而将废水中的氮转变为气态氮。NO在NOR作用下还原为N₂O。N₂O形成和转化由NOR和NOS控制。结果表明，IC均提高了参与NOR和NOS的基因丰度，但颗粒中norB/C丰度比絮体少，而颗粒中nosZ更多。这表明，颗粒相比于絮体具有形成N₂O更少但更强的N₂O转化能力。还原产生的氮气通过固氮作用变为氨，IC加强了该过程，并且在颗粒中更明显。基因丰度结果表明，在整个氮循环网络中主导硝酸盐还原的路径是硝酸盐异化还原。硝酸盐异化还原为氨(M00530)与氨完全硝化(M00804)相循环，产生的一部分硝酸盐被反硝化(M00529)路径转化，最终转化为氮气。

图3. (a) 4个反应器在第60天的未颗粒化污泥、第160天的絮体污泥和颗粒污泥(F160, G160)中与ko00910相关的基因丰度。(b)根据模块重新绘制单元集。在基因柱状图中，样本从左到右的顺序与(a)相同，基因丰度为模块中具有相同功能的基因的总和。

关键酶活化性

硝化和反硝化是废水生物脱氮的主要路径，分别检测四个反应器的颗粒和絮体中脱氮路径关键酶的含量以表达IC对氮代谢能力的影响（Fig. 4）。硝化路径中，颗粒污泥中AMO随投加量增加而增加（Fig. 4a），其差异和AOR相符，说明AMO含量与AOR呈正相关。虽然宏基因结果表明IC使hao丰度下降，然而，作为高铁细胞色素C的HAO在IC的作用下含量增加（Fig. 4b），但IC对于HAO的作用在颗粒和絮体之间差异并不显著。NO₂^--N分别在NXR催化氧化和NIR催化还原下转化为NO₃^--N和NO，其活性都将影响NO₂^--N积累。显然，IC提高了NXR和NIR活性(Fig. 4c, f)，并且随着IC投加量提高，颗粒的NXR和NIR活性逐渐提高并超过絮体，导致添加IC的体系中NO₂^--N不被积累。

完整的反硝化路径中，常规的AGS反应器中絮体的NAP比颗粒多，而IC扭转了这一规律并提高了其含量（Fig. 4d）。NAR、NIR、NOR都含有铁作为活性中心，铁可以在酶的电子传递链和配基中作为电子受体，从而增强微生物群落的代谢活性。系统中NAR的含量大约是NAP的两倍（Fig. 4e），厌氧反硝化占主导地位。IC同步提高颗粒和絮体的NAR，颗粒中的NAR始终多于絮体。IC对污泥在NOR和NOS的作用是相反的（Fig. 4g, h）。IC削弱了污泥的NOR活性，而促进了NOS活性。并且更多的IC投加量使这个结果在颗粒中比絮体更明显。NO₂^-的积累是抑制NOS活性的主要因素，而本研究中NO₂^-积累随IC投加量显著减少。显而易见，减少NO₂^-积累和改善污泥的酶活性可以减少N₂O形成的潜力。IC可能发挥减少系统中N₂O形成的潜力，并且IC培养的颗粒比絮体具有更低的N₂O形成潜力。

图4. 氮代谢关键酶活性：(a) AMO; (b) HAO; (c) NXR; (d) NAP; (e) NAR; (f) NIR; (g) NOR; (h) NOS。

IC产物对微生物群落的影响

IC在有氧条件下氧化释放铁离子，水解会导致不溶性(氢)氧化物的沉淀，形成铁泥。反应器若没有主动排泥，这将持续作用于污泥中。铁泥以纳米球状无定形铁氧化矿物包裹在细胞表面，由此形成矿物结壳会阻碍微生物摄氧从而抑制代谢活性。为了探索IC产物对微生物群落的影响，向反应器中投加铁泥粉末（ISP）和FeCl₂。在长期运行下，微生物群落和功能发生变化（Fig. 5）。

三个反应器的污泥样本（A：对照组；B：ISP；C：FeCl₂）分别成组进行PCoA（Fig. 5a）。C组各样本距离最近，表明Fe²⁺对微生物群落结构影响不显著。反观B组各样本距离远，特别是B20偏离B40和B60，这可能是由于微生物对ISP的应激反应导致群落结构显著变化，但微生物可以逐渐适应高负荷的ISP并逐渐恢复群落结构。ko00910丰度变化表明ISP和Fe²⁺均具有提高氮代谢路径的能力（Fig. 5b），但持续的ISP投加使氮代谢能力在第60天下降，在具体的模块中也具有这样的规律。A和C组的代谢能力在60天的运行中均保持稳定提高（Fig. 5c）。从硝酸盐跨膜运输发现第20天ISP的M00615丰度下降相比于其他组，说明ISP造成的矿物结壳会影响细胞膜的渗透性。长期运行下，微生物逐渐适应ISP并迅速提升代谢能力。尤其在氨氧化和硝酸盐还原的路径中，40天的模块丰度远高于20天，ISP促进微生物代谢的影响超过Fe²⁺。铁矿物沉淀在细胞外，可以通过增强质子动力来增加细胞代谢能量的产生。持续的ISP投加到第60天达到7 g/L，高含量的ISP也会使微生物代谢能力略微下降，但依旧强于对照组。综上，ISP和Fe²⁺均具有提高氮代谢的作用，而投加ISP的污泥的代谢能力需要经历一个适应再激增的过程。

图5. (a)样本组中PCoA的差异。PICRUSt2函数预测(b)氮代谢丰度和(c)模块丰度的变化。