花药孢子体组织绒毡层对花粉形成的贡献
1. 上海师范大学生命科学学院植物分子科学重点实验室，中国上海200234。2. 上海师范大学生命科学学院植物种质资源开发中心，中国上海200234。†通讯作者（电子邮件 znyang@shnu.edu.cn）。![]()
花粉的正常形成对于植物的繁殖至关重要。在花药中，小孢子母细胞经过减数分裂形成包含四个单倍体小孢子的四分体。从四分体中释放出来后，小孢子逐步发育为成熟的花粉粒。绒毡层是花药体细胞的最内层，可以为小孢子的发育提供营养、酶和花粉壁原料。基于雄性不育的表型，目前已经克隆到许多控制绒毡层和花粉发育的关键基因。在此，我们重点介绍拟南芥中参与绒毡层发育的DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遗传通路。我们还比较了这条遗传通路在拟南芥、水稻和玉米等不同物种中的基本情况。基于这条途径，我们综述了最近的研究发现，阐明绒毡层在分子水平对花粉形成的贡献：1）绒毡层为小孢子发育提供营养；2）绒毡层提供关键酶降解四分体的果胶和胼胝质壁，从而释放小孢子；3）绒毡层合成花粉壁前体物质的分子调控途径；4）绒毡层提供花粉外被的前体物质；5）绒毡层提供小RNA以调控生殖细胞中基因的甲基化修饰。花药是植物繁殖的重要器官，负责产生并释放成熟的花粉粒。围绕于生殖细胞的花药壁由四层体细胞组成，包括表皮、内皮层、中层和绒毡层[1]（图1）。表皮层在花药的发育中起保护作用，内皮层负责花药开裂以释放成熟花粉粒[2]。绒毡层是直接与小孢子接触的一层细胞，会发生细胞程序性死亡（PCD）。一般认为绒毡层细胞在小孢子的发育过程中作为“滋养细胞”，支持小孢子的发育。中层普遍存在于种子植物中，但其功能尚不清楚。有人提出，中层细胞可能发挥与绒毡层相似的功能，主要通过PCD促进小孢子的发育[3]。在开花植物中，绒毡层的功能异常会导致雄性不育，说明绒毡层在雄配子体发生中的重要性[4]。在农业中，雄性不育植物是杂交育种的必要材料，对于提高作物产量具有重要作用 [5]。![]()
图1. 花药和花粉的结构
在拟南芥中，每个花药有四个药室（花粉囊），药室周围的花药壁由表皮、内皮层、中层和绒毡层组成。成熟的花粉粒在药室中产生。一个成熟的花粉粒包含一个营养细胞和两个精细胞。花粉粒表面覆盖着一层结构复杂的花粉壁。Ep, epidermis，表皮，; En, endothecium，内皮层; ML, middle layer，中层; T, tapetum，绒毡层; Vn, vegetative nucleus，营养核; Sc, sperm cell，精细胞; PM, plasma membrane，质膜。
在药室中，二倍体的小孢子母细胞经过减数分裂形成四分体。从四分体中释放后，小孢子经过两轮有丝分裂形成成熟的花粉粒[6]。在这些过程中，花粉壁的结构和组成发生了剧烈变化（图2）。小孢子母细胞表面的初生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶组成[7,8]。在减数分裂之前，初生细胞壁的纤维素被降解，此时细胞壁主要由果胶组成，因此该结构也被称为果胶壁[9,10]。在减数分裂开始时，一层由β-1,3-葡聚糖组成的胼胝质壁在细胞膜和果胶壁之间形成。当减数分裂完成时，四个单倍体小孢子包裹在胼胝质壁和果胶壁内形成四分体[10]。在四分体阶段后期，在小孢子的质膜和胼胝质壁之间形成初生外壁，由多糖、纤维素和蛋白质组成[11]。目前广泛认为初生外壁决定了花粉外壁（孢粉素壁）模式形成。每个植物物种有独特的孢粉素壁结构，这种结构是植物分类的重要依据。花粉外壁的主要成分是孢粉素，这是一种极具生化抵抗力的材料[12]。在小孢子质膜形成波浪形后，孢粉素在波峰处沉积，并逐步形成完整的花粉外壁结构[13]。花粉外壁可以进一步分为外壁外层和外壁内层。当花粉外壁初步形成后，在外壁和小孢子质膜之间形成花粉内壁 [14,15]。最后，油脂类物质会填充在外壁外层的缝隙中，这些油脂类物质形成的结构被称为花粉外被。具有多层壁结构的花粉成熟后从花药中释放[12]。目前，关于花粉壁结构、孢粉素生物合成和花粉壁形成，已发表了多篇优秀的综述 [16-21]。![]()
图2. 花粉发育过程中细胞壁发生的系列变化
橙色四边形代表绒毡层细胞，绒毡层细胞下方是对应时期的小孢子或花粉。在第7期，四个小孢子包围在胼胝质壁和果胶壁中。在第7期晚期，外壁外层（sexine）和外壁内层（nexine）的前体开始沉积在质膜外侧。在第9到第10期，绒毡层开始降解并变成海绵状。在第10期，内壁出现在质膜和外壁内层（nexine）之间。在第11期，绒毡层明显降解，花粉外被（pollen coat）前体开始填充在花粉外壁网状结构的空隙中。在第12和13期，多层花粉壁结构形成，绒毡层细胞完全降解。
所有陆生植物的小孢子囊或花药中都存在绒毡层。在绒毡层细胞中过量表达核酸酶会导致雄性不育，表明绒毡层细胞的功能与花粉正常发育之间存在密切联系[23]。作为小孢子生长的“滋养细胞”，绒毡层细胞具备高效转录和翻译活性。在拟南芥中，绒毡层细胞在发育后期转变为极性分泌型细胞。每个绒毡层细胞含有两个细胞核，其细胞质浓缩并且富含大量质体、线粒体和活跃的囊泡运输系统。在花药发育过程中，绒毡层细胞经历程序性死亡，为花粉提供酶和花粉壁原料[24-28]。基于细胞学观察，绒毡层细胞对花粉发育的贡献已得到广泛研究。近年来，在雄性不育植物中发现了许多对花药发育至关重要的基因，这些基因多数在绒毡层细胞中表达，并且对花粉形成至关重要。在拟南芥中，已经证实了绒毡层中五个特异的转录因子对花粉形成至关重要。DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1（DYT1）和ABORTED MICROSPORE（AMS）是basic helix-loop-helix（bHLH）家族成员[29-31]。DEFECTIVE IN TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION 1（TDF1）和MS188/MYB103/MYB80 编码R2R3 MYB转录因子[32]。MALE STERILITY 1（MS1）是一种plant homeodomain（PHD）-finger家族转录因子[33,34]。在dyt1、tdf1 和ams 的突变体中，绒毡层细胞膨大占据了药室并挤压小孢子[32]。在突变体ms188 和ms1 中，绒毡层细胞也出现膨大的发育缺陷。然而，药室形态可以正常维持，这表明它们在绒毡层发育后期起着重要作用[33-37]。通过基因表达、细胞学和遗传分析，确定了一条遗传调控通路（DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1）[38]。除了这五个关键转录因子外，还有几个其他的转录因子冗余地参与绒毡层的发育调控。两个GAMYB-like基因，MYB33 和MYB65，影响了绒毡层和花粉的发育。在myb33 myb65 双突变体中，绒毡层膨大导致花粉败育。这一表型与tdf1 相似。在低温或强光照条件下，myb33 myb65 的育性恢复，这表明MYB33 和MYB65 在低温下可以调节育性[39]。此外，拟南芥中的三个bHLH 基因，bHLH010、bHLH089 和bHLH091，对早期绒毡层发育起冗余作用。bhlh010 和bhlh089 单突变体表现出正常的育性。然而，bhlh 三突变体的绒毡层细胞异常膨大并且呈不规则排列，这与dyt1 的表型相似。这三种bHLH蛋白与DYT1相互作用，可能影响DYT1的功能。在bhlh 三突变体中，MYB103、MS1 和MYB99 的表达量减少。这表明这三种bHLH转录因子通过与DYT1相互作用并影响MYB103、MS1 和MYB99 等多个靶基因的表达，冗余地调控绒毡层发育[40,41]。近十年来，分子和生化证据进一步表明，在绒毡层发育过程中，该遗传调控通路中的五个基因依次被激活。DYT1直接与TDF1 的启动子结合来激活其转录。DYT1 启动子驱动的TDF1 表达，可以恢复dyt1 突变体中AMS、MS188、MS1 和一系列花粉壁相关基因的转录，表明DYT1通过TDF1 调控绒毡层遗传通路的下游调控因子以及花粉壁的形成[42]。TDF1直接调控AMS 的表达[43]，进而调控MYB80/MS188 的表达[44,45]。最终，MYB80/MS188调控MS1 的表达[46]（图3）。基于这个遗传通路，形成了几个正向反馈回路，以促进下游靶基因的表达[43,44]（图3）。TDF1与AMS相互作用以激活其对下游基因表达的调控。此外，AMS和MS188形成复合物，促进孢粉素合成基因的表达[47,48]。这些转录因子与正向反馈回路一起形成了一个快速调控绒毡层发育和花粉形成的调控网络。这些转录因子的详细下游因子在后面部分进行了综述和总结（表1）。水稻也存在该通路中五个转录因子的同源基因[20,49-53]（图3）。Undeveloped tapetum1（UDT1）是与DYT1高度同源的bHLH转录因子，调控绒毡层细胞发育和分化[49]。OsTDF1 是拟南芥TDF1 的同源基因，ostdf1 基因敲除突变体表现出绒毡层细胞空泡化且异常膨大的表型，与tdf1 突变体的表型相似[53]。TAPETUM DEGENERATION RETARDATION（TDR）基因作为AMS 的同源基因，在水稻中已被证明是调控绒毡层发育的关键成员，并且对花粉的脂肪代谢也是至关重要的[50,54]。PERSISTANT TAPETAL CELL1（PTC1）/OsMS1 是拟南芥MS1 的同源基因[50,52,54]。最近报道了OsMS188/OsMYB80 的功能。osms188/osmyb80 突变体表现出绒毡层异常降解、外壁外层缺失和小孢子败育等表型[55,56]。与拟南芥类似，水稻绒毡层也存在OsUDT1-OsTDF1-OsTDR-OsMS188-PTC1这一遗传调控通路[53,56]。在玉米中，AtDYT1/OsUDT1、AtTDF1/OsTDF1、AtAMS/OsTDR、AtMS188/OsMS188和AtMS1/OsPTC1的同源基因分别是ZmMs32、ZmMs9、ZmbHLH51、ZmMYB84 和ZmMs7 [57-62]。这五个基因的突变都会导致雄性不育，他们也形成调控绒毡层发育和功能的遗传通路[57-62]。由此可见，拟南芥、水稻和玉米中由这五个关键转录因子组成的遗传通路高度保守[20]。除了这五个保守的转录因子外，在水稻中还发现了另外两个bHLH家族成员，其亦对绒毡层的发育发挥至关重要的功能。ETERNAL TAPETUM 1 （EAT1）/DTD1/bHLH141通过直接调控两个天冬氨酸蛋白酶编码基因OsAP25 和OsAP37 的转录，正向促进绒毡层细胞的细胞程序性死亡（PCD）[63,64]。TDR INTERACTING PROTEIN2（TIP2）/bHLH142调控了TDR 和EAT1 的表达[65,66]。TIP2/bHLH42与TDR相互作用形成异源二聚体，并调控EAT1 的表达。EAT1和TIP2与bHLH010、bHLH089和bHLH091具有序列相似性。然而，与拟南芥中三个bHLH基因在绒毡层发育中的冗余作用不同，tip2 和eat1 单突变体均表现出绒毡层PCD延迟。这一发现表明它们都是水稻绒毡层PCD的重要调节因子。除了PCD延迟的表型外，tip2 （而非 eat1 ）的花药壁三层体细胞在第7期到第8期仍保持未分化状态，表明了TIP2 在这些细胞分化中具有特定功能[63,65]。图3. 拟南芥和水稻绒毡层中的基因调控网络
以箭头结尾的线表示正向调控，以半圆形结尾的线表示相互作用。橙色和灰色的椭圆形分别标记拟南芥和水稻中关键的转录因子。在拟南芥中，DYT1-TDF1-AMS负责绒毡层早期发育。AMS通过TEK和MS188分别调控外壁内层（nexine）和外壁外层（sexine）的形成。MS1负责花粉外被的形成。TEK, transposable element silencing via AT-hook; BES1, BRI1 EMS SUPPRESSOR 1; UDT1, undeveloped tapetum1; TDR, tapetum degeneration retardation; PTC1, PERSISTANT TAPETAL CELL1。
植物激素对植物生长至关重要。生长素（IAA）、赤霉素（GA）和油菜素内酯（BR）的激素信号参与了绒毡层的遗传调控网络，影响花药和花粉的发育（图3）。生长素参与花药形态发生和花粉形成[67-69]。生长素响应因子ARF17在小孢子母细胞、小孢子、绒毡层和药室内壁中表达[70-72]。在arf17 突变体中，绒毡层发育出现缺陷，花粉壁无法正常形成[70,71]。然而，ARF17与DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遗传通路之间的调控关系尚不清楚。除了在绒毡层中的功能外，ARF17还参与胼胝质降解和花药开裂[70,72]。BR突变体表现出异常的绒毡层发育、花粉形成减少和不规则的花粉外壁结构[73,74]。BRI1 EMS SUPPRESSOR 1（BES1）是BR信号通路中的关键因子。BES1在拟南芥中作用于DYT1的上游，调控绒毡层发育[73,74]。除了拟南芥中GAMYB突变体myb33 myb65 发现的绒毡层缺陷外，水稻中的GA-deficient、GA-insensitive和gamyb 突变体也出现了绒毡层PCD异常和花粉外壁形成异常的缺陷[75]。此外，外源赤霉素的应用弥补了低温胁迫导致的雄性不育[76]。这些结果表明赤霉素参与了花药/花粉发育的调节。DELLA/SLR1是赤霉素信号传导的中心负调节因子。与myb33 myb65类似，在缺失两个DELLA编码基因REPRESSOR OF ga1-3（RGA）和GA INSENSITIVE（GAI）的双突变体中，绒毡层细胞也存在肥大现象[77]。最近有报道称，水稻DELLA/SLR1是绒毡层发育所必需的[78]。在水稻SLR1突变体中，绒毡层的程序性死亡过早发生，花粉无法形成正常花粉壁进而败育。SLR1与绒毡层的重要转录因子OsMS188相互作用协同激活孢粉素生物合成基因，如CYP703A3，DEFECTIVE POLLEN WALL（DPW）和POLYKETIDE SYNTHASE（PKS1），以及与孢粉素转运相关基因ABCG15 的表达。这些基因的激活与花粉壁的后续形成密切相关[78]。因此，GA-DELLA-OsMS188这一模块控制雄性生殖发育的调控通路。从四分体释放后，小孢子浸泡在药室腔内的营养液中，在花药发育过程中这些药室腔液体的成分会发生变化。在小孢子发育早期，药室腔液体中含有糖类、蛋白质、氨基酸和孢粉素的前体物质；在花粉成熟后期，则含有花粉外被形成的前体物质[79,80]。这些药室腔液体中的物质由绒毡层细胞分泌，以满足小孢子正常生长发育的需求[80]。胞外转化酶（extracellular invertase）负责糖类的水解[81]。在烟草中，Nin88 编码一种胞外转化酶的同工酶，它在绒毡层和花粉中特异表达。Nin88 的反义抑制或在Nin88 启动子下过表达一个转化酶抑制剂都会导致烟草花粉发育的中止[82,83]。AtcwINV2 是拟南芥中Nin88的同源基因，它在花药中特异表达。AtcwINV2 的反义抑制导致种子结实减少并抑制花粉萌发[84]。这些结果表明，花药特别是绒毡层中糖类及其水解产物对花粉的形成至关重要[82,83,85]。在水稻中，CARBON STARVED ANTHER（CSA）编码一个绒毡层特异表达的R2R3 MYB转录因子。CSA负责调节MST8的转录。MST8是单糖转运蛋白，在花药发育期间作用于糖类分配[86]。镁离子是细胞生存必需的二价金属阳离子。在植物中，镁离子转运蛋白（magnesium transporter，MGT）负责镁离子的吸收和转运。在拟南芥中，MGT家族含有10个成员[87,88]。MGT4、MGT5和MGT9在花粉中表达，具有从花药腔室液中吸收镁离子，用于花粉发育[89,90]。此外，MGT5和MGT6在绒毡层中表达[91,92]。在mgt5、mgt5+/-和mgt6+/-突变体中，花粉出现异常的有丝分裂，花粉内壁也有缺陷，并最终导致花粉败育。AMS直接调节MGT5 的表达，将镁离子从绒毡层运输到药室腔液体中[91]（图4）。总之，MGT5 发挥了孢子体基因和配子体基因的双重功能，它不仅能将镁离子从绒毡层运出，还负责将镁离子吸收进入花粉中。与此同时，其他MGT可能在绒毡层或花粉中发挥重要或冗余的作用，为花粉生长提供足够的镁离子。
除了营养功能外，绒毡层还负责四分体壁的降解。四分体壁由薄的果胶壁和厚的胼胝质壁组成。四分体壁的降解可以确保小孢子成功释放到药室腔中，进行下一步发育。果胶壁由homogalacturonan, rhamnogalacturonan I和rhamnogalacturonan II组成。果胶的降解需要果胶甲酯酶（pectin methylesterases，PMEs）和多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases，PGs）[93-95]。果胶降解失败会导致四个花粉粒相互粘连。这种表型在拟南芥的quartet（qrt）突变体中观察到[10,96,97]。目前，已经克隆了三个QRT 基因。QRT1 编码果胶甲酯酶（PME），而QRT2 和QRT3 编码多聚半乳糖醛酸酶（PGs）[98-100]。果胶首先由QRT1去甲基化，然后由QRT2和QRT3降解，以松弛和降解果胶壁。所有这些QRT 基因都在绒毡层细胞中表达，并分泌到药室腔中。研究发现孢粉素合成的直接调控因子MS188也直接调控QRT3 的表达[10]（图4）。用A9 启动子在绒毡层中过早表达QRT3 会导致花粉外壁的形成不规则，表明果胶壁的及时降解对花粉壁的形成非常重要[10]。胼胝质壁主要由β-1, 3-葡聚糖组成。胼胝质减少或缺失会导致花粉壁结构异常，表明胼胝质层对孢粉素的沉积至关重要[35,70,101-103]。β-1, 3-葡聚糖酶（callase）从绒毡层细胞分泌，用于降解胼胝质[104-106]。在拟南芥和油菜中，花药特异蛋白6（anther-specific protein 6，A6）被认为是一个降解胼胝质壁的β-1, 3-葡聚糖酶[107]。然而，在a6 突变体中，胼胝质壁可以正常降解，暗示其他编码β-1, 3-葡聚糖酶的基因也参与了四分体胼胝质壁的降解。A6在绒毡层中特异表达，并在小孢子释放前表达达到峰值。在ms188 突变体中，A6 的表达下降伴随着胼胝质壁降解延迟[35]。同样，在ams 突变体中，A6 的表达也有所减少，且胼胝质的积累和降解都存在异常。AMS和MS188可能通过调控A6 的表达来调控胼胝质壁的降解[35,108]（图4）。UNEVEN PATTERN OF EXINE1（UPEX1）/KAONASHI （KNS4）/ RESTORER OF REVERSIBLE MALE STERILE 3（RES3）编码一种糖基转移酶，受绒毡层中AMS的直接调控[109-111]。在res3 突变体中，绒毡层中A6和其他β-1, 3-葡聚糖酶的分泌出现延迟，进而影响了四分体中小孢子的释放。由此可见，AMS和MS188可能调控A6及其家族多个成员进而调控胼胝质壁降解。res3 突变体胼胝质壁降解延迟可以恢复多个雄性不育系的育性，提示可能是育性恢复的共性机制[111]，暗示其在作物杂交育种中的应用前景。
花粉外壁由外壁外层和外壁内层组成。外壁外层的主要成分是孢粉素，由长链脂肪酸和芳香族化合物聚合而成。基于遗传表型和生化活性，由长链脂肪酸开始逐步加工形成孢粉素前体的复杂通路已有详细报道[17,21]。在这个生化途径中，如ACYL-CoA SYNTHETASE5（ACOS5）, CYP703A2, CYP704B1, POLYKETIDE SYNTHASE A（PKSA）, PKSB, TETRAKETIDE α-PYRONE REDUCTASE1 （TKPR1）, TKPR2和MALE STERILE 2 （MS2）等一系列催化酶在绒毡层中参与其中[17,21]。ACOS5可能作为脂酰CoA起到作[112]。CYP703A2和CYP704B1是细胞色素P450家族的两个成员，参与不同长链脂肪酸的羟基化反应[113,114]。羟基化产物可以由MS2转化为脂肪醇，或者由PKSA和PKSB催化成三酮和四酮α-吡喃酮[115,116]。然后，四酮α-吡喃酮经过TKPR1和TKPR2还原成聚羟基化的四酮[117-119]。这些酶大多在绒毡层细胞中丰富或特异表达[47,48,108]（图4）。在ms188 突变体中，外壁外层完全缺失[35]。MS188直接调控这些基因的转录，以建立外壁外层[48]。MS188的上游调控因子AMS也能结合到一些重要的花粉壁形成基因的启动子，例如CYP703A2、CYP704B1、PKSB 和TKPR1[108]。此外，AMS与MS188之间可以相互作用。AMS和MS188可能形成一个正向反馈通路，促进孢粉素合成基因的表达，以形成外壁外层[47,48]。合成的孢粉素前体可能由ATP-binding cassette transporter超家族成员进行转运，如拟南芥中的ABCG26或水稻中的ABCG15[120-123]（图4）。这些ABCGs 的表达也受绒毡层细胞转录因子的调控[56,108]。总的来说，孢粉素前体的生物合成和输出主要由绒毡层细胞中的MS188调控。
除了长链脂肪酸，酚类物质也是孢粉素的重要组成部分。早在1987年，研究人员就在孢粉素中检测到了几种酚类物质[124]。然而，不同的孢粉素降解产物检测产生了矛盾的结果[125]。2019年，Li及其同事表明，松树的孢粉素主要由脂肪烯基-多酮衍生的聚乙烯醇单元和7-O-对香豆酰化的C16脂肪基单元组成[126]。然而，2020年，Mikhael等人进行了高分辨率X射线光电子能谱（HR-XPS）检测，显示石松的孢粉素外壁中缺乏芳香类化合物[127]。薛等人利用遗传学、生物化学和细胞生物学技术发现苯丙烷类衍生物是维管植物孢粉素的另一种必要组成成分。拟南芥中编码苯丙烷合成途径相关酶的基因在绒毡层中表达。但是，核磁共振研究显示，蕨类植物和石松植物的孢粉素成分与种子植物存在差异[128]。已知孢粉素可以吸收紫外线以保护花粉[129]，薛等人证明苯丙烷类衍生物对花粉的紫外线保护是必不可少的[128]。总之，遗传证据表明脂肪基单元和苯丙烷酚是孢粉素壁的必要组成部分。
外壁内层位于外壁外层和内壁之间。通常，在种子植物中，可以在透射电子显微镜下观察到这层细胞壁。由于难以分离外壁内层进行成分分析，目前对这一层细胞壁的了解相当模糊。在拟南芥中，TRANSPOSABLE ELEMENT SILENCING VIA AT-hook（TEK）编码AT-hook nuclear localized（AHL）蛋白。tek 突变体中外壁内层缺失，但外壁外层可以正常形成，表明外壁外层的形成与外壁内层无关[44]（图4）。在绒毡层中，AMS通过直接调控MS188/MYB80 控制外壁外层的形成。在第7期的花药中，TEK 在绒毡层中强烈表达，而该表达也是受到了AMS的直接调控[44]。因此，AMS通过直接调控MS188 参与外壁外层形成，并通过调控TEK 控制外壁内层的形成（图4）。研究发现TEK 影响编码阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）基因的转录[130]。然而，外壁内层中是否存在AGPs仍有待证实。
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图4. 绒毡层中控制花粉形成的分子调控途径
橙色不规则的形状代表绒毡层细胞。绒毡层调控了大量与花粉发育相关的因子：提供花粉生长所需的镁离子；分泌降解果胶壁和胼胝质壁的关键酶，使小孢子从四分体中释放；提供外壁外层（sexine）和外壁内层（nexine）的前体物质；以及提供形成花粉外被的原料。
绒毡层提供花粉外被形成的前体物质
花粉外被覆盖或填充在外壁外层网状结构的缝隙中，负责花粉与柱头的相互作用以及花粉的水合作用，同时也负责保护花粉免受恶劣环境胁迫[13,131-136]。最近，发现了两种花粉外被的特异性染料：pollen-coat-stain 52（PCS52）和PCS 184。在被子植物中，这两种花粉外被染料与花粉外壁碱性品红（BF）染料一起可以清晰地染出花粉外被和花粉壁[137]。
花粉外被由蛋白质、脂质、类异戊二烯和糖类复合物共同组成[133,138]。在水稻中，OsOxidosqualene cyclases （OsOSC12）编码一个双环三萜合成酶，参与三萜途径，它在绒毡层细胞中表达。OsOSC12 缺乏导致花粉外被缺陷，并呈现出湿度敏感雄性不育（humidity-sensitive genic male sterility，HGMS）表型。这些发现表明绒毡层合成的三萜类物质是花粉外被中防止花粉脱水的重要组分[139]。在拟南芥中，花粉外被蛋白组学分析显示，花粉外被蛋白主要由两个家族组成：脂质结合油脂蛋白（lipid-binding oleosin）或富含甘氨酸的蛋白（glycing-rich protein，GRP）和细胞外脂酶（extracellular lipase，EXL）[140]。GRP17在拟南芥花粉外被蛋白中所占比例最大[140]。GRP17 的突变影响花粉水合和竞争能力，表明该蛋白在水合中的重要性[141]。EXL4和EXL6也在花粉外被中被发现[140]。在exl4 突变体中，花粉水合速度较慢。作为一种脂肪酶，EXL4可能会改变脂质组成以提高花粉吸收柱头水分的能力[142]。脂质是花粉外被的另一个重要组分，对花粉与柱头的交流和花粉的水合至关重要。在花粉外被中检测到的大多数脂质是超长链脂肪酸（very-long-chain fatty acids，VLCFAs）的衍生物[143]。许多干扰长链脂质合成的突变体，比如eceriferum 1（cer1）, cer3/faceless pollen-1（flp-1）/wax2/yre, 3-ketoacy-CoA synthase 7（kcs7） kcs15 kcs21 , 和long-chain acyl-CoA synthetases 1 （lacs1） lacs4, 表现出花粉外被缺陷[143-146]。3-酮酰CoA合酶（3-Ketoacy-CoA synthase，KCS）促进脂肪酸延长的作用[147,148]。CER1 和 CER3/FLP1/WAX2/YRE 可能编码脂肪酸羟化酶，并参与超长链烷烃的合成[149-153]。有研究表明，几种花粉外被蛋白或与脂质合成相关的酶主要或特异地在绒毡层细胞中表达[46,108,146,154,155]，表明绒毡层在为花粉外壁形成提供物质方面起着重要作用。ms1 是1968年在拟南芥中最早报道的雄性不育突变体[156]。MS1是一种plant homeodomain（PHD）-finger家族的转录因子[33]。ms1 突变体的花粉壁存在缺陷[157]。研究发现MS1 调控了几种花粉外被蛋白基因的转录，比如GRP14、GRP17、GRP18、GRP19、EXL4 和 EXL6，以及花粉外被脂质合成基因，比如KCS7、KCS15 和KCS21 [46,108,146]（图4）。有趣的是， GRP19、EXL6、KCS20 和 KCS21 蛋白在绒毡层降解之前就已经被分泌到药室腔中[46,146]。这些结果表明在绒毡层降解之前，花粉外被前体可能在MS1的调控下提前做好了储备，而不是在绒毡层降解后被动地释放到药室腔中。MS1 受 MS188 的直接调控。这表明，在MS188介导的孢粉素合成和外壁外层形成之后，MS1 随后调控花粉外被蛋白基因的表达。这些揭示了花粉壁多层结构建立过程中的绒毡层级联调节通路（图4）。
绒毡层提供了花粉外被的主要成分。最近的研究表明，药室内壁和发育中的小孢子也参与了花粉外被的形成[136,158-162]。CER2和CER2-like 蛋白被认为是VLCFA延伸所需的BAHD酰基转移酶。CER2、CER2L2 和KCS6 均在药室内壁中表达[162]，cer2 cer2l2 和cer6/kcs6 突变体都表现出严重的花粉外被缺陷[163-167]。cer2 cer2l2 和 cer6/kcs6 突变体都能形成花粉粒，但是不能水合导致雄性不育。在柱头添加外源超长链脂肪酸能够恢复育性，提示药室内壁合成的超长链脂肪酸参与花粉与柱头的互作和水合过程。CER2、CER2L2 和KCS6 在药室内壁中的表达明显晚于绒毡层花粉外被基因的表达，推测绒毡层首先将花粉外被蛋白和脂质分泌到花药室中，沉积在花粉外被后，药室内壁合成的超长链脂肪酸覆盖在花粉外被表面，参与花粉与柱头的黏附与水合[162]。花粉产生的富含半胱氨酸的花粉外被蛋白也参与花粉与柱头的相互作用[159,160,168-170]。POLLEN COAT PROTEIN B-class peptides（PCP-Bs）是富含半胱氨酸的花粉外被蛋白[169]。最近有研究显示，花粉产生的PCP-Bs结合到ANJEA–FERONIA（ANJ–FER）受体激酶复合物，以降低柱头的ROS并促进花粉水合[170]。因此，花粉外被物质是由绒毡层、小孢子和药室内壁合成并提供。
表1. 在花粉和花药发育过程中发挥重要功能的基因
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绒毡层提供小RNA以调控生殖细胞的基因甲基化
小RNA通过调控靶基因以及转座子的表达，参与对植物发育的调控。此前已有报道拟南芥和水稻中具有花粉特异的miRNA[171,172]。拟南芥MYB33/MYB65 和水稻OsGAMYB/OsGAMYB-like 基因的转录受到miR159的靶向作用[39,173]。在拟南芥和水稻中过量表达miR159都会引起花药缺陷并导致雄性不育，说明miR159-GAMYBs需要受到严格调控以维持花药的正常发育[173,174]。ARF17 是miR160的靶基因，5mARF17 在ARF17与miR160匹配的区域引入碱基突变，以避免miR160对ARF17的切割。实验显示5mARF17 转基因植株表现出明显的绒毡层发育缺陷，表明miR160对ARF17的精准调控对绒毡层的发育至关重要[71]。最近报道了越来越多来自不同物种野生型和雄性不育植物花药的miRNA组（microRNAome） [175-178]。未来，对这些microRNA的研究有助于花药发育和花粉形成的深入理解。
小RNA会引起花粉中基因组的变化。在拟南芥花粉中，转座因子（transposable elements，TEs）仅在营养细胞中被激活。然而，转座因子来源的siRNAs却在花粉和精细胞中都有所积累，这表明来自营养核的siRNA可以在精细胞中发挥作用[179]。在玉米花药中，有两类phased siRNAs：21-nt phased siRNAs (phasiRNAs)和24-nt phasiRNAs。24-nt phasiRNAs及其前体在绒毡层和小孢子母细胞均有积累，然而，绒毡层而非小孢子母细胞可能才是这些小RNA合成的主要来源[180]。在玉米中，Dicer-like 5（Dcl5）在形成24-nt phasiRNAs的过程中发挥重要作用。在dcl5 突变体中，几乎没有检测到24-nt phasiRNAs，且绒毡层细胞出现发育缺陷。同时，该突变体表现出温敏雄性不育。这些结果表明DcL5和24-nt phasiRNAs对于绒毡层的正常发育非常重要，且绒毡层是24-nt phasiRNAs的主要来源[181]。最近，拟南芥中的研究发现，24-nt siRNAs是通过染色质重塑因子CLASSY 3（CLSY3）在绒毡层中合成。绒毡层产生的siRNA随后调控生殖细胞的甲基化并沉默生殖细胞中的转座子[182]。类似的机制也在玉米中被发现，Zhou X.等人报道24-PHAS前体和Dcl5主要积累在绒毡层中，24-nt phasiRNAs合成后可能从绒毡层移动到小孢子母细胞和花药壁的其他体细胞层[183]。总之，在拟南芥和玉米中，正常花药和生殖细胞发育所需的24-nt siRNA主要由绒毡层提供，并进入生殖细胞发挥功能。在近几十年的研究中，已经确定了绒毡层发育调控的关键转录因子。在拟南芥中，DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遗传通路不仅对绒毡层发育很重要，还为花粉发育提供了级联调控。首先，DYT1和TDF1调控绒毡层的早期发育，此时小孢子母细胞在药室中进行减数分裂。在四分体阶段，AMS通过激活 TEK 的表达调控外壁内层的形成，并通过MS188调控孢粉素前体物质的合成以促进外壁外层的形成。此外，AMS和MS188在果胶壁和胼胝质降解中也发挥着关键作用，使得四分体中的小孢子得以成功释放。最后，遗传通路中的下游成员MS1调控了一系列与花粉外被相关基因的转录，促进花粉外被的形成。由此，具有多层花粉壁结构的熟花粉粒适时从花药中释放。该遗传通路在拟南芥、水稻和玉米中相对保守。然而，拟南芥和水稻中其他调控因子同源基因的功能存在差异，例如拟南芥的bHLH010/bHLH089/bHLH090和水稻的bHLH141/bHLH142。因此，有必要探索更多的参与不同物种绒毡层的调控因子，分析它们与这条关键转录因子通路之间的调控关系，以建立更全面的绒毡层发育基因调控网络。未来，绒毡层发育与花粉形成之间的协调发育关系仍有待探索，孢粉素的成分仍有待解析。尽管外壁内层是种子植物中保守的花粉壁层次，但其化学成分仍不清楚。在花药发育过程中，小孢子母细胞的初生细胞壁将逐步转变为花粉壁，这种转变对于花粉形成和植物育性非常关键。期间，降解小孢子母细胞初生细胞壁和四分体胼胝质的酶仍有待鉴定。在不同物种中进一步研究这些问题将有助于我们更深入地了解花药孢子体组织与小孢子/花粉之间的关系，以及花粉壁的演化。此外，研究关键基因在绒毡层发育中的突变是否也会导致各种作物的不育表型，探索这些雄性不育材料在杂交育种中的应用前景也非常重要。
本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号：31970520，31870296）。
我们感谢上海师范大学的朱骏教授、楼悦教授和薛景石教授对本文的讨论和修改。感谢上海师范大学的潘铿羽、朱本顺和姜宇对本文的修改。我们感谢上海师范大学的叶柯，张弛，陈家杰对本文中文版翻译工作的帮助。
中文版全文：
花药孢子体组织绒毡层对花粉形成的贡献-中文版全文.pdf
原文链接：
https://doi.org/10.48130/SeedBio-2022-0005
SeedBio-2022-0005.pdf
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