单细胞思路系列如约进行！整体而言有寻找发病机制、图谱研究、分子功能研究、诊断或预测标志物研究几大类，上一期分享的主要是分子功能研究。本期则给大家分享的单细胞思路是：预测标志物相关研究。
文献一:eBioMedicine IF = 9.7
EBioMedicine vol. 96 (2023): 104801.
doi:10.1016/j.ebiom.2023.104801
DNA damage repair profiling of esophageal squamous cell carcinoma uncovers clinically relevant molecular subtypes with distinct prognoses and therapeutic vulnerabilities
DNA 损伤修复 (DDR) 是维持基因组完整性的关键过程。作者分析了来自自己机构和其他公开队列的 377 例 ESCC（食管鳞状细胞癌） 病例的bulk和单细胞转录组学数据，以确定主要的 DDR 亚型。DDR 变异分析使作者能够识别出两种不同的 DDR 亚型，即 DDR_active和 DDR_silent，它们在局部区域 ESCC 中表现出独立的预后价值，但在转移性 ESCC 中则不然。DDR_silent亚型的特点是微环境发炎但免疫抑制，免·疫细胞浸润相对较高、免疫检查点表达异常、T 细胞耗竭以及癌症相关通路富集。此外，DDR 亚型表明BRCA1和HFM1是局部区域 ESCC 中强大且独立的预后因素。
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图1 关注的通路及相关基因
通过文献中建立了六条 DDR 通路和 268 个相应基因（图1），并使用基于通路基因集的 ssGSEA 计算每条 DDR 通路的患者水平活动评分，然后作者进行了单变量 Cox 回归分析，观察到六条 DDR 通路中的四条 (MMR、NER、FA 和 HR 通路) 与生存率提高显著相关（图2）。
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图2 DDR通路中4条与临床预后有关
因此，作者利用来自四条 DDR 通路的 151 个基因的表达谱，使用共识聚类对 SCH 队列中的所有 155 名患者进行分组，并确定了生存结果不同的 DDR 簇。 DDR actice（称为 DDR活跃）簇与生存率提高相关，而 DDR silent簇与生存率较差相关（HR = 0.483，95% CI 0.268–0.872，对数秩和检验 P = 0.014），并在不同队列中得以验证（图3）。
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图3 通路定义的
DDR_active/silent通路中与临床预后有关
进一步评估了四种 DDR 通路中的 151 个基因对局部区域 ESCC 患者的预后影响，并观察到使用单变量 Cox 回归模型有八个 DDR 基因与生存结果显着相关。在控制性别、年级、吸烟史和饮酒史的多变量分析中，只有两个 DDR 基因BRCA1和HFM1仍然与生存结果保持显着相关性，并在不同队列中验证（图4）。
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图4 从通路聚焦到基因，
BRCA1和HFM1与临床预后有关
由此作者基本找到了能够预测临床预后的通路以及基因，接下来作者便进行基础、生信以及进一步干预的研究，就不再赘述。
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Cancer cell vol. 42,10 (2024): 1747-1763.e7.doi:10.1016/j.ccell.2024.09.008
A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophageal squamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial
47名患有局部晚期可切除的食管鳞状细胞癌（ESCC）的患者接受了三轮含有pembrolizumab的化疗，随后进行达芬奇机器人辅助手术，发现外周血中TRGC2+ NKT细胞的扩增与新辅助治疗的有效性相关，来看一看作者是怎么验证这群细胞的。从接受新辅助治疗的12名患者中收集了配对的外周血（n = 12）和肿瘤组织样本（n = 12），并进行了单细胞测序。根据对新辅助治疗的反应进行统计发现受益于新辅助治疗的患者外周血中TRGC2+ NKT细胞亚群的比例显著增高，而在肿瘤组织中则无显著差异。（图5）![]()
接下来进行进一步生信分析，发现TRGC2+ NKT细胞群体主要富集于细胞杀伤、白细胞介导的细胞毒性、细胞溶解、白细胞介导免疫、自身细胞介导的细胞毒性和凋亡等过程。NKT细胞亚群的分化轨迹显示TRGC2+ NKT细胞位于该轨迹的末端，负责执行细胞杀伤和抗原呈递功能。TRGC2、FGFBP2和NKG7是其关键基因。（图6）
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图6 目标细胞群处于拟时序分析轨迹末端
尽管在外周血中，TRGC2+ NKT细胞亚群在反应良好的患者中显示出显著较高的比例，但在肿瘤组织中，TRGC2+ NKT细胞亚群在良好反应组与不良反应组之间的分布并无显著差异，提示在外周血和肿瘤组织之间细胞的迁移、发挥作用还需进一步展示（图7）。
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图7 对目标细胞群亚群进行分析
进一步作者对亚群进行分析，发现幼稚TRGC2+ NKT细胞亚群随着时间的推移演变为癌性和效应性TRGC2+ NKT细胞，同时在细胞演化过程中伴随细胞毒性基因的转录水平变化，并且趋化因子如CCL5和CCL21的表达显著增加（见图7），这表明趋化细胞因子在招募TRGC2+ NKT细胞亚群进入肿瘤微环境中发挥重要作用。进一步研究了细胞间相互作用，提示免疫细胞和肿瘤细胞增加的和趋化因子相互作用对；并检测了基线患者TRGC2+ NKT细胞亚群水平，提示反应良好者基线水平细胞亚群高。进一步提示TRGC2+ NKT细胞亚群作为疾病治疗反应的预后标志物。
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图8 提取细胞群进行体外实验以及公共数据库验证
接下来作者从四名不同患者中分离外周血单核细胞（PBMCs），并排序得到TRGC2+ NKT细胞。将这些细胞与PBMCs以不同的比例（0.25:1、0.5:1、0.75:1和1:1）混合后，与患者源性肿瘤类器官（PDOs）共同培养，发现随着TRGC2+ NKT细胞比例的增加，凋亡的PDO比例显著增加。此外，联合培养显示在高TRGC2+ NKT比例组中，GRZMB+ CD3+ T细胞的百分比显著提高，强调了这些细胞的细胞毒潜力（图8B-C）。同时，PBMC被分离为TRGC2+和TRGC2- NKT细胞亚群，随后与PDO共同培养发现TRGC2+ NKT细胞共培养后，PDO的凋亡比例显著高于TRGC2- NKT组，TRGC2+ NKT组中粒酶B阳性CD3+ T细胞的比例也有所上升（图8E-F）。进一步，作者还通过外部数据分析，首先是公共单细胞数据集GSE203115，发现在对新辅助治疗反应良好的患者组中，TRGC2+ NKT细胞的比例显著高于反应不佳的患者组。此外TRGC2+ NKT细胞的评分在反应良好组中明显更高，表明TRGC2+ NKT细胞浸润与免疫治疗效果之间存在强相关性。并通过结合其他数据库中数据证明在手术反应良好组中TRGC2+ NKT和效应TRGC2+ NKT的得分更高（图8I-J），通过ROC分析显示TRGC2+ NKT细胞（AUC = 0.810）和效应TRGC2+ NKT细胞（AUC = 0.930）在预测治疗反应方面的效力超过了传统免疫激活标志物。
有自己的临床队列或者公共数据库资源（例如：TCGA、GEO数据库等）通过生信分析、机器学习、独立队列验证、实验验证等方法通过Kaplan-Meier分析等进一步确认。临床预测模型大家可以点击链接跳转学习哦。那么这就是本期的全部内容啦，大家学会了吗！欢迎大家持续关注，我们一同学习进步！大家对于推送内容有任何问题或建议可以在公众号菜单栏“更多--读者的话” 栏目中提出，我们会尽快回复！[1]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37725855/[2]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39406186/请添加下方微信，备注：“R语言与组学_互助交流群” 将拉入群中。
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