当今，高通量组学测序技术可谓是高分文章的宠儿，科研工作者的宝器，尤其是在绘制疾病图谱、发现关键靶点、揭示疾病机制、找寻生物标志物以及推动个性化医疗等领域。Bulk RNA-seq就像是基础实验中的Western Blot（WB），是一项必备的核心生物信息学分析技能。现在开始学习，永远不算晚。跟随我们一起，重新启程，深入探索bulk RNA-seq的无限可能！
01 Circulation丨Spatiotemporal Multi-Omics Mapping Generates a Molecular Atlas of the Aortic Valve and Reveals Networks Driving Disease. （IF=35.6）文章整体研究思路与目的：将手术获得的人主动脉瓣依据病变程度分为非病变（ND）、纤维化（F）和钙化区域（C），依据空间结构分为纤维层、海绵层和心室层。通过多组学技术（包括转录组学和蛋白组学）对主动脉瓣进行时空映射，构建其分子图谱，并进一步探索其与疾病相关的分子网络。
▶ 运用bulk组学的目的：探明不同疾病阶段过表达的转录本数量，以及与蛋白组学重合的差异表达分子数量。- 【定性】层次聚类（hierarchical clustering）和主成分分析（PCA）；显示钙化阶段与非疾病阶段在基因表达上有显著差异，纤维化阶段则处于两者之间(Fig. 1C)。
- 【定量】为了进一步了解每个阶段的特征，研究者确定了每个阶段中过表达的转录本（过表达定义为某个阶段相对于其他两个阶段表达水平增加≥1.2倍）。RNA测序结果表明，非疾病、纤维化和钙化阶段分别有114个、103个和587个过表达的转录本。
- 【对比】通过比较转录组学和蛋白组学得到的差异表达分子，可以看到二者的整体相关性较低（Spearman R²=0.25），但仍有少数共同的分子标志物。这些分子在不同阶段的过表达表明CAVD在每个阶段都由不同的分子进行驱动（Fig. 1D）。
Fig 1. CAVD组学研究设计和CAVD疾病相关阶段
▶ Bulk组学对下一步分析的意义：相较于蛋白组学，RNA-seq灵敏度更高，能够捕捉到蛋白质组学探测不到的基因表达变化。在钙化阶段，RNA测序显示出更多的过表达转录本，提示钙化阶段的细胞环境更加复杂，存在更多的免疫细胞浸润。然而，由于蛋白质才是驱动疾病发展的主要功能实体，研究决定在后续研究中重点关注主动脉瓣的蛋白组学数据。
02 Circulation丨Integrative Multiomics in the Lung Reveals a Protective Role of Asporin in Pulmonary Arterial Hypertension （IF=35.6）关键词：
gene expression profilingpulmonary arterial hypertension
文章整体研究思路与目的：通过分析最大规模的PAH肺脏生物样本库（包括96个PAH患者样本和52个对照样本）中的转录组数据，并结合临床病理数据、全基因组关联研究（GWAS）、贝叶斯调控网络、单细胞转录组学和药物转录组学等多种数据来源，发现Asporin（ASPN）作为关键枢纽基因，在PAH中显著上调。且这种上调是对抗PAH的补偿性反应，可抑制PAH患者肺动脉平滑肌细胞的增殖，并抑制转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD2/3信号通路的激活。最后，使用Su-Hx大鼠模型，发现敲低Asporin基因加重了PAH的症状，而重组Asporin则能够缓解PAH的症状。
▶ 运用bulk组学的目的：发现与PAH严重度及易感性相关的基因模块
▶ 分析方法：
无监督层次聚类、主成分分析（PCA， Fig. 2B）：PAH患者和对照组在转录组层面存在显著差异；PAH亚组间无显著差异。表明不同亚组在临床表现上可能有所不同，但并没有明显的转录组异质性。
差异表达基因（DEGs）：PAH患者与对照组之间共有5253个差异表达基因（FDR < 0.05），约占整体转录组的22%。其中，2719个基因上调，2534个基因下调。
加权基因共表达网络分析（WGCNA，Fig. 2C-E）：共识别出20个基因共表达模块。
(1) 模块与表型的关系：粉红色模块与PAH严重程度和临床特征最具相关性，具体表现为肺扩散能力下降、平均肺动脉压及肺血管阻力升高、肺动脉内膜增厚。皇家蓝模块也与PAH诊断呈正相关；黄绿色模块与PAH呈负相关。
(2) 模块与基因的关系：粉红色和皇家蓝模块主要富集PAH肺组织中上调的基因，黄绿色模块则富集PAH肺组织中下调的基因。
遗传关联分析（Fig. 2G）：只有粉色模块在PAH相关的单核苷酸多态性（SNPs）中有显著富集，表明粉红色模块不仅与PAH的诊断和严重度相关，而且其中的基因失调可能与PAH的遗传风险密切相关，表明其在PAH的遗传易感性中可能起到重要作用。
Fig 2. 共表达网络分析揭示了与肺动脉高压的严重程度和遗传风险相关的模块
▶ Bulk组学对下一步分析的意义：通过去卷积分析（deconvolution analysis）推测参与PAH相关基因共表达模块的细胞类型，以及如何进一步结合细胞类型和组织特异性信息来丰富对PAH的理解。
Comment
随着单细胞转录组学以及空间转录组学技术的不断普及，单纯的bulk RNA-seq可能无法满足高质量研究的要求。若想在这一领域脱颖而出，我们可以从以下几个角度进行深化和创新：由于罕见病通常样本量有限，传统的基因组学方法难以有效揭示其分子机制，因此转录组学能够提供有关病理过程、特定基因表达变化等信息，帮助研究者发现潜在的治疗靶点。多中心研究可以通过增加样本多样性，减少偏倚，提高研究的广泛适应性和外部验证的可靠性。通过联合不同地区或国家的研究机构进行样本收集，可以增强研究结果的普适性和可重复性，增加研究的可信度。同时，随着大规模样本库的建立和大数据技术的应用，这类研究在确保足够样本量的基础上，能够提高结果的统计功效和临床转化价值。传统的病例对照研究虽然能够揭示一些疾病相关基因，但由于样本分组通常较为粗糙，容易忽略疾病的异质性。更精细的分组，如根据患者的基因型、表型、疾病亚型、治疗反应等特征进行分组，可以帮助深入探究不同亚群体的分子机制差异，从而提高研究的精度。例如，在癌症研究中，根据肿瘤的分子亚型进行转录组分析，能够发现更具特异性的生物标志物或潜在靶点。转录组学研究不仅要关注基础研究，还要强调与临床的结合。通过与临床样本、治疗反应数据和预后数据的结合，研究者能够发现更加可靠的生物标志物和治疗靶点，从而为个性化治疗方案的制定提供支持。尤其是在癌症、神经退行性疾病等领域，将转录组学研究与临床数据结合，能够加速基础研究成果的转化。
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