责编︱王思珍
饮酒对疼痛具有复杂而矛盾的影响，尽管过量饮酒与多种疼痛状况的发生和严重程度有关[1-3]，但急性酒精治疗会产生镇痛作用[4]。以前对酒精相关痛觉过敏的研究通常集中在酒精依赖状态。例如，临床调查和动物研究表明，酒精使用障碍患者和长期接触乙醇的啮齿动物在戒酒期间表现出疼痛敏感性增强[5-6]。酒精使用障碍患者通常会恢复饮酒以缓解戒断相关疼痛，从而增加进一步复发的风险[7-11]，一些研究报告称戒断引起的痛觉过敏发生在酒精依赖状态发展之前[12-14]，但这种现象的潜在神经机制仍不清楚。近日，中国科学技术大学晋艳/张智、皖南医学院第一附属医院麻醉科Chen Yongquan 、上海交通大学医学院仁济医院心理医学科Luo Yanli 团队合作在Science Advances杂志在线发表了题为“ A neural circuit for alcohol withdrawal–induced hyperalgesia in a nondependent state” 的研究论文。在这项研究中，研究者团队建立了一种小鼠在酒精成瘾前戒断（EW）期间的痛觉过敏模型，以研究发病窗口和潜在机制。研究团队使用在体微型显微镜和双光子钙成像进行病毒追踪和分析，确定了一条从背海马CA1谷氨酸能神经元（dCA1Glu）到前扣带皮层谷氨酸能神经元（ACCGlu）的神经环路，该环路在患有痛觉过敏的EW小鼠中被激活。化学遗传学抑制该通路可以减轻EW小鼠的痛觉过敏，而人工激活这条环路会使小鼠重现EW诱导的痛觉过敏。这些发现揭示了dCA1Glu → ACCGlu神经通路参与驱动小鼠在酒精依赖之前EW诱导的痛觉过敏。（拓展阅读：张智课题组相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Nat Commun︱中国科学技术大学张艳/刘新峰/张智团队揭示慢性疼痛-快感缺失共病的神经机制；Science︱张智/陶文娟/刘元渊团队合作揭示声音调控疼痛的神经机制）
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为了探索小鼠产生酒精依赖之前短期戒酒对疼痛敏感性的影响，研究者建立了小鼠持续饮酒模型，即让小鼠自由饮用20%乙醇2周，每6天进行一次24小时的戒断期。在第二次停止饮酒24小时后，研究者发现在用一系列Von Frey纤维丝刺激EW组小鼠（EW小鼠）右后爪时，机械阈值明显低于对照小鼠 ，但不影响热阈值。此外，焦虑通常被认为是酒精戒断的特征性表型障碍，表明人对酒精有依赖性。旷场测试（OFT）和高架十字迷宫（EPM）测试结果表明EW小鼠并没有出现焦虑样的行为。在建模两周期间对小鼠每天对酒精的摄取量、戒断后血浆的酒精含量监测，以及建模两周后戒断期酒精和蔗糖水的饮水偏好测试，证明小鼠在整个建模过程没有产生酒精依赖。因此，研究者证明小鼠两周后的酒精戒断会引起小鼠痛觉敏化，但不会引起酒精依赖。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）海马体（尤其是背侧CA1）是大脑中酒精的敏感靶点脑区，可能与急性或慢性饮酒或戒酒相关的疾病有关。为了研究dCA1是否以及如何在EW诱发的痛觉过敏中发挥作用，研究者首先通过免疫荧光染色检测了该区域中的c-Fos表达。与对照组相比，EW小鼠的dCA1中的c-Fos信号显著增加，并且和谷氨酸抗体共定位。接下来，研究者进一步探究EW对小鼠dCA1区谷氨酸能神经元的影响。通过电生理和微型显微镜体内钙成像的方法发现EW小鼠的dCA1Glu神经元的神经元活动的频率和强度明显高于对照组。这些结果共同表明，在小鼠形成酒精依赖性之前，短期戒酒期间 dCA1Glu 神经元放电活性显著增加。接下来，研究者通分别过化学遗传学抑制和化学遗传学激活的方法抑制和激活dCA1Glu 神经元。化学抑制小鼠dCA1Glu 神经元显著增加EW小鼠痛觉阈值，而化学激活小鼠dCA1Glu 神经元显著降低小鼠痛觉阈值。这些结果表明 dCA1Glu 神经元确实导致小鼠 EW 相关的痛觉过敏。图2. 短期饮酒后的酒精戒断引起dCA1Glu 神经元活动增强。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）接下来，研究者进一步探究dCA1神经元的下游投射脑区。研究发现前扣带回（ACC）、外侧内侧丘脑核、丘脑角核和腹侧CA1均接受较强的dCA1投射。由于ACC整合痛觉感觉信息，研究者关注到了从dCA1投射到ACC的通路。为此，研究者使用了顺向单突触追踪策略，在野生小鼠中，将 AAV-hSyn-Cre 病毒注射到dCA1 ，将AAV-DIO增强型绿色荧光蛋白（EGFP）病毒注射到ACC 。注射3周后，可以在 ACC中观察到表达EGFP的神经元，并且主要与谷氨酸抗体共定位。这些结果证实了直接dCA1 → ACC通路的存在。此外，单突触狂犬病的逆向追踪和光遗传电生理的结果共同验证了dCA1Glu神经元投射到ACCGlu神经元的通路。以上表明 dCA1Glu神经元向ACCGlu神经元发送功能性、单突触、兴奋性谷氨酸能投射。图3. dCA1Glu 投射到 ACCGlu 神经元。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）鉴于上述发现，研究者假设，如果ACC神经元在兴奋状态下由dCA1Glu神经元支配，那么在短期酒精摄入戒断期间增加该通路的支配应该会导致ACC神经元的兴奋性增加。为了在单细胞水平上观察ACCGlu神经元活动的变化，研究者进行了体内双光子钙成像，结果显示，与对照小鼠相比，在第二次EW后24小时，在EW小鼠中观察到的GCaMP6m标记的ACCGlu神经元的钙信号强度显著增加。为了探究在短期酒精摄入EW后 ACCGlu神经元对机械刺激的敏感性，研究者体内光纤记录ACC中表达 AAV-CaMKIIα-GCaMP6m的自由活动的C57小鼠的钙信号，以确定ACCGlu神经元是否对亚阈值刺激敏感。结果表明，在第二次EW后24小时，在EW小鼠的右后爪上施加0.07 g von Frey纤维丝刺激后，ACCGlu神经元中的钙信号迅速增加。同时，体内微型显微镜在单细胞层面上看到了和光纤记录一致的结果。这些结果表明，在小鼠产生酒精依赖性之前， ACCGlu神经元参与EW后的痛觉敏感。图4. 短期饮酒后的酒精戒断引起ACCGlu 神经元活动增强。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）由于EW 相关痛觉过敏的小鼠的dCA1Glu → ACCGlu通路输入增强，研究者接下来进一步研究兴奋性dCA1Glu输入对EW小鼠中ACCGlu神经元过度活跃的影响。体内双光子钙成像表明，在EW小鼠中，通过选择性抑制dCA1Glu神经元活动可以抑制GCaMP6m标记的ACCGlu神经元活性。在EW Thy1-YFP小鼠中，将CNO微量给药到ACC选择性抑制dCA1Glu → ACCGlu通路，ACCGlu神经元的兴奋性增加被显著消除。行为学的结果表明，特定化学遗传学沉默该通路活性也可减轻EW小鼠在第二次EW后24小时的痛觉过敏。此外，体内双光子钙成像表明，化学遗传学激活dCA1Glu神经元可增加未饮酒C57小鼠ACCGlu神经元的荧光强度。向ACC微注射CNO激活ACC中的dCA1Glu神经末梢可降低未饮酒C57小鼠的机械阈值。总之，这些结果表明，dCA1Glu → ACCGlu通路的兴奋在小鼠对乙醇产生依赖之前戒断诱发的痛觉过敏的发展中起着因果作用。图5. 操纵 dCA1Glu → ACCGlu通路活性影响小鼠短期饮酒后戒断引起的痛觉过敏。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）鉴于在EW期间观察到的机械阈值降低可能持续长达3天，研究者还研究了dCA1Glu →ACCGlu通路在与EW相关的长期痛觉过敏发展中可能发挥的作用。为此，研究者在第二次EW后72小时记录dCA1Glu神经元活动。研究者向ACC注射retro-AAV-CaMKIIα-EGFP 病毒，记录脑切片中向ACC投射的dCA1Glu神经元动作电位；另外，研究者向ACC注射retro-AAV-CaMKIIα-Cre病毒，向dCA1注射AAV-DIO-GCaMP6m病毒，记录向ACC投射的dCA1Glu神经元钙活动。结果表明，在第二次EW后72小时，特异性投射到ACC的dCA1Glu神经元的动作电位发放频率，以及钙瞬变频率和强度显著增强。鉴于上述发现，研究者进一步探究由这种增加dCA1Glu神经元活动驱动的dCA1Glu → ACCGlu通路活性增强是否是维持EW期间痛觉过敏所必需的。微型内窥镜记录表明EW 小鼠的ACCGlu神经元钙瞬变频率和强度均增强。此外，第二次EW小鼠的对侧后爪受到0.07 g von Frey刺激后，ACCGlu神经元的钙信号频率和强度显著增加。此外，注射CNO抑制dCA1Glu → ACCGlu通路活性可以在第二次EW后72小时部分恢复EW小鼠的机械阈值。总之，这些结果表明，dCA1Glu→ ACCGlu通路活性增强在调节非酒精依赖状态下小鼠与 EW 相关的长期痛觉过敏方面发挥作用。图6. dCA1Glu → ACCGlu 回路对短期酒精摄入戒断期间长期痛觉过敏的影响。（图源：Yang, et al., Science Advances. 2024）酒精戒断综合征包括一系列身体和心理障碍，尤其是痛觉过敏 ，这是临床复发的重要指标。先前的研究通常集中在成瘾阶段慢性酒精暴露引起的戒断诱发痛觉过敏 ，但很少有研究聚焦在非酒精依赖阶段短期酒精戒断期间诱发疼痛敏化的潜在神经回路机制和关键时间窗口。研究这一科学问题，可能有助于酒精戒断痛觉敏化治疗、以及制定预防酒精使用障碍的策略。在这项研究中，研究者建立了一种非依赖状态下酒精戒断引起的痛觉过敏的小鼠模型。研究团队发现酒精戒断引起的痛觉过敏可能在非依赖阶段的成瘾发展早期发生，在神经环路机制层面上，定义了一种dCA1Glu → ACCGlu的神经通路，EW期间从dCA1Glu神经元到ACCGlu神经元的输入异常激活，激活该通路导致非依赖性小鼠短期酒精戒断后痛觉过敏。这一研究研究成果为酒精戒断后诱发的痛觉敏化治疗提供了机制见解和干预靶标，有助于发展酒精戒断后诱发的痛觉敏化治疗的方法。
原文链接：https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adp8636转载须知：“逻辑神经科学”团队原创性内容，著作权归“逻辑神经科学”所有，欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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