铁死亡（Ferroptosis）是一种新的受调控细胞死亡形式，其特征是铁依赖性的脂质过氧化积累，涉及各种病理生理过程，包括癌症。靶向铁死亡是一种新的抗癌策略，鉴定 FDA 批准的药物作为铁死亡诱导剂被视为癌症治疗的新方法。尽管越来越多研究表明抗糖尿病药物二甲双胍作为抗癌剂的潜在有效性，但其确切的机制尚未完全阐明。2021 年 6 月 23 日，浙江大学附属邵逸夫医院周济春/王林波团队在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 杂志上发表题目为「Metformin induces Ferroptosis by inhibiting UFMylation of SLC7A11 in breast cancer」的文章。通过免疫沉淀和免疫组织化学染色等技术，发现二甲双胍通过抑制 SLC7A11 的 UFM 修饰诱导铁死亡，增加细胞内 Fe²⁺和脂质 ROS 水平，抑制肿瘤生长。体内实验验证了二甲双胍在裸鼠原位移植肿瘤模型中的效果。
同时，二甲双胍与 SLC7A11 抑制剂 SAS 协同作用，进一步增强铁死亡和抑制乳腺癌细胞增殖。该研究首次揭示了二甲双胍诱导铁死亡的新机制，并确定了 SLC7A11 作为 UFM 修饰的新底物，提出靶向 UFM1/SLC7A11 通路作为癌症治疗的新策略。越来越多的证据表明，二甲双胍在临床环境中具有预防和治疗乳腺癌的巨大潜力，并且二甲双胍能够有效抑制乳腺癌的增殖。作者的研究显示，二甲双胍能够以剂量和时间依赖的方式有效抑制某些乳腺癌细胞的增殖（图 1A）。接下来，作者探讨了二甲双胍在乳腺癌细胞中的抗癌活性是否与这些已知的受调控细胞死亡形式相关。作者使用了多种细胞死亡抑制剂，包括 Z-VAD-FMK（一种凋亡抑制剂）、necrosulfonamide（一种坏死性凋亡抑制剂）和 3-甲基腺嘌呤（3-MA，一种自噬抑制剂）。由于已知二甲双胍能够调节细胞内铁稳态，这可能与细胞代谢有关，作者还引入了一种铁螯合剂，去铁胺（DFO）。结果显示，DFO 与二甲双胍共同培养的 T47D 和 MCF7 细胞恢复了细胞活力（图 1B）。在作者的研究中，Z-VAD-FMK、necrosulfonamide 和 3-MA 与 DMSO 相比，也略微提高了细胞活力（图 1B），并且 DFO 的效果远远显著于凋亡和自噬抑制剂（图 1b）。此外，二甲双胍促进了铁离子的积累，DFO 抑制了铁离子水平的增加（图 1C 和 D）。碘化丙啶染色明确了 DFO 抑制了二甲双胍诱导的 T47D 细胞死亡（图 1E）。综上结果，表明铁离子对于二甲双胍的抗癌效果是必需的，并且二甲双胍诱导的铁离子增加可能是其发挥抗癌作用的机制之一。为了明确二甲双胍与铁死亡之间的关系，作者首先研究了二甲双胍对铁死亡形态特征的影响。铁死亡的一个独特形态特征是线粒体体积减少和膜密度增加。透射电子显微镜显示，二甲双胍在 MCF7 和 T47D 细胞中诱导了线粒体体积减少和膜密度增加（图 2A）。接下来，作者重点研究了二甲双胍对铁死亡生化过程的影响，包括总 ROS 和脂质过氧化物的积累（这些可以被铁死亡抑制剂 DFO 和 Fer-1 抑制）以及细胞内 GSH 水平的降低。因此作者用不同浓度的二甲双胍处理乳腺癌细胞，并使用相应的试剂盒检测这些指标。不出所料，结果显示，二甲双胍增加了细胞内总 ROS 和脂质 ROS 水平，并且脂质 ROS 的增加可以被铁死亡抑制剂（DFO 和 Fer-1）抑制，而 DFO 和 Fer-1 本身对这些指标几乎没有影响（图 2B 和 C）。此外，二甲双胍降低了细胞内 GSH 水平（图 2D）。此外，作者测试了铁死亡抑制剂（DFO 和 Fer-1）是否能够逆转二甲双胍的抗癌效果。结果显示，当 T47D 细胞用二甲双胍处理时，DFO 和 Fer-1 均能显著恢复细胞活力（图 2E）。此外，碘化丙啶染色确认了 Fer-1 抑制了二甲双胍诱导的 T47D 细胞死亡（图 2F）。综上所述，二甲双胍可以诱导铁死亡。接下来，作者研究了二甲双胍如何诱导铁死亡。铁死亡由脂质过氧化触发，并且由半胱氨酸-谷氨酸逆向转运系统的关键组分 SLC7A11 严格调控。GPX4 和 GSH 协同调节脂质过氧化。GSH 的生成受 SLC7A11 调控，SLC7A11 是谷氨酸转运系统中的关键因素，在铁死亡通路中起重要作用。为了确定二甲双胍调控铁死亡的具体分子机制，作者检测了不同浓度和处理时间的二甲双胍对 SLC7A11 和 GPX4 表达的影响。结果显示，二甲双胍在剂量和时间依赖性方式下有效抑制了 T47D 和 MCF7 细胞中 SLC7A11 的表达，而其转录水平显著升高（图 3A 和 B）。此外，二甲双胍对 GPX4 表达没有显著影响（图 3A）。为了进一步明确 SLC7A11 在二甲双胍抗癌作用中的作用，作者在 T47D 细胞中过表达 SLC7A11，以检测二甲双胍敏感性及其对脂质 ROS 和 GSH 水平的影响，结果显示过表达 SLC7A11 显著逆转了二甲双胍的抗癌效果和 GSH 的上调（图 3C 和 D）。这些结果表明，二甲双胍可以通过下调 SLC7A11 蛋白水平诱导铁死亡以抑制癌症。UFM 化是一种类似于泛素的修饰，在乳腺癌的发生和发展中起重要作用。UFM1 系统在后生动物和植物中是保守的，但在酵母中不存在，这表明其在多细胞生物中具有特定的作用。基于 DRUGSURV 数据库分析（DRUGSURV：一种基于患者生存信息的已批准和实验性药物在肿瘤学中的再定位资源），作者发现 UFM1 可以间接地被二甲双胍靶向（图 4A）。作者推测 UFM1 可能在二甲双胍的抗癌作用中起某种作用。为了检测二甲双胍对 UFM1 的调控作用，作者测试了二甲双胍对 UFM1 表达的影响。结果显示，二甲双胍在一定程度上抑制了 UFM1 蛋白和整体 UFM 化修饰水平（图 4B），但不影响 UFM1 的转录水平（图 4C）。为了进一步明确 UFM1 对二甲双胍抑制肿瘤活性的影响，作者在 T47D 细胞中过表达了 UFM1。结果显示，过表达 UFM1 有效阻止了二甲双胍的抗癌作用，并恢复了二甲双胍介导的 GSH 水平的抑制（图 4D 和 E）。综上所述，二甲双胍可能通过 UFM1 发挥其抗癌作用，UFM1 可以调节 GSH 水平。5. 二甲双胍通过抑制 SLC7A11 的 UFM 化下调 SLC7A11 的表达铁死亡由脂质过氧化触发，并由半胱氨酸-谷氨酸逆向转运系统的关键组分 SLC7A11 严格调控，因此，探索其调控机制有助于在癌症治疗中找到进一步诱导铁死亡的新治疗靶点。结果表明，铁死亡诱导剂 erastin 下调了 UFM1 和 SLC7A11 的表达，表明 UFM1 可能参与铁死亡调控。为了阐明 UFM1 在二甲双胍调控铁死亡中的作用，作者首先检测了不同乳腺癌细胞系中 SLC7A11 和 UFM1 的表达。结果显示，SLC7A11 和 UFM1 蛋白水平之间存在明显的正相关性（图 5A）。接下来，利用公开数据库，作者的生物信息学分析显示 SLC7A11 的表达与乳腺癌患者预后之间存在显著的负相关性，但 UFM1 则没有（图 5B）。为了确定 SLC7A11 和 UFM1 是否具有调控作用，作者检测了敲低 UFM1 后 SLC7A11 的表达效果。结果显示，敲低 UFM1 下调了 SLC7A11 的表达，但不影响其转录水平（图 5C）。此外，敲低 UFM1 降低了 SLC7A11 的蛋白稳定性（图 5D）。为了确定 SLC7A11 是否可以被 UFM1 修饰，作者在敲低或未敲低 UFM1 的条件下检测了 SLC7A11 的 UFM 化。结果发现，SLC7A11 是 UFM 化的底物，其修饰的特异性通过敲低 UFM1 得到确认（图 5E）。UFM1 与目标蛋白的共价结合可以被 UfSP2 酶逆转。进一步的 UFM 化修饰检测显示，SLC7A11 的 UFM 化可以被 UfSP2 抑制（图 5F）。这些发现将 SLC7A11 定义为 UFM1 的新修饰底物。此外，为了阐明二甲双胍调控 SLC7A11 的具体分子机制，作者使用二甲双胍处理的细胞检测了二甲双胍对 SLC7A11 UFM 化水平的影响。结果显示，二甲双胍有效抑制了 SLC7A11 的 UFM 化水平（图 5G）。综上所述，二甲双胍通过抑制 SLC7A11 的 UFM 化来下调 SLC7A11 蛋白稳定性，从而诱导铁死亡。图 5 二甲双胍通过抑制 SLC7A11 的 UFM 化下调 SLC7A11 的表达目前，许多研究已经表明，二甲双胍可以直接作用于肿瘤细胞，并通过 AMPK 依赖和/或 AMPK 非依赖的信号通路发挥其抗肿瘤生物学效应。作者的结果也显示，二甲双胍可以激活 AMPK 的磷酸化（图 6A）。因此，为了确定 AMPK 通路是否参与了二甲双胍对铁死亡的调控，作者首先明确 AMPK 的激活是否可以诱导铁死亡。结果显示，AMPK 激活剂 AICAR 增加了脂质 ROS 的生成并抑制了 SLC7A11 的表达，这表明 AMPK 的激活可以诱导铁死亡（图 6E 和 F）。为了进一步确定 AMPK 通路在二甲双胍诱导的铁死亡中的作用，作者在有或没有 AMPK 抑制剂 Compound C 的条件下，用二甲双胍处理细胞。有趣的是，结果显示二甲双胍和 Compound C 的结合可以协同增加脂质 ROS 的水平，并抑制 GSH 的水平和 SLC7A11 的表达（图 6A、B、C）。此外，Compound C 本身可以增加脂质 ROS 和 Fe²⁺的生成（图 6C 和 D）。因此，这表明 AMPK 的平衡对于细胞生存至关重要，AMPK 的激活或抑制可能会在细胞中引发应激反应，其中可能涉及铁死亡。总之，无论是二甲双胍还是 AMPK 失衡都可以诱导铁死亡，而二甲双胍可能在不涉及 AMPK 的情况下诱导铁死亡。图 6 二甲双胍可独立于 AMPK 通路诱导铁死亡7. SAS 和二甲双胍的协同作用可有效抑制乳腺癌基于之前的数据，作者探究使用 SAS（sulfasalazin，一种 SLC7A11 抑制剂）是否会增强二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡，从而使癌细胞对二甲双胍更敏感。作者将细胞处理成二甲双胍与 SLC7A11 抑制剂 SAS 的组合。随后，使用 CCK8 法检测细胞活力，以确定二甲双胍和 SAS 组合的协同作用。结果显示， SAS 与二甲双胍的组合可以以协同方式抑制乳腺癌细胞的增殖（图 7A）。SAS 与二甲双胍的组合诱导线粒体体积减少和膜密度增加（图 7B）。进一步的脂质过氧化和 GSH 检测表明，二甲双胍和 SAS 的组合显著增加了脂质 ROS 水平并抑制了 GSH 的生成（图 7C 和 D）。DFO 和 Fer-1 有效减弱了二甲双胍与 SAS 组合的杀伤效果（图 7E）。综合来看，作者的数据表明 SAS 与二甲双胍的组合协同诱导脂质过氧化和铁死亡，从而抑制乳腺癌的增殖。图 7 SAS 和二甲双胍的协同作用可有效抑制乳腺癌作者研究了在体内 SAS 是否会增强二甲双胍的抗癌活性。将 T47D 细胞皮下植入免疫缺陷裸鼠的右侧背部。一周后，携瘤小鼠被随机分为四组，随后分别用 DMSO、二甲双胍、SAS 或二甲双胍与 SAS 联合处理。结果显示，与 DMSO 组相比，二甲双胍和 SAS 显著抑制了肿瘤生长（图 8A 和 B）。在四组中，二甲双胍与 SAS 联合组在抑制肿瘤生长方面效果最显著（图 8A 和 B）。此外，接受二甲双胍和 SAS 处理的小鼠显示出更低的 UFM1 和 SLC7A11 表达以及更高的 4-HNE 表达，4-HNE 常被用作组织中氧化应激的通用标志物（图 8C）。这些数据表明，SAS 使癌细胞对二甲双胍诱导的脂质过氧化和铁死亡更加敏感，从而在体内抑制肿瘤。图 8 在体内 SAS 协同增强二甲双胍的抗癌活性本研究首次建立了二甲双胍与铁死亡之间的联系，具体联系如下：SLC7A11 可以被 UFM1 修饰；二甲双胍通过抑制 SLC7A11 的 UFM 化，下调 SLC7A11 蛋白稳定性，从而以 AMPK 非依赖的方式诱导铁死亡，发挥其抗癌作用。这些发现揭示了二甲双胍的抗癌新机制，为癌症治疗提供了新的思路。未来的工作将需要确定细胞对铁死亡的敏感性和耐受性的决定因素，以及这些反应与其他类型受调控细胞死亡之间的机制联系，将有助于进一步挖掘二甲双胍在不同遗传或肿瘤环境下的治疗效用，为癌症患者的临床治疗提供新的范例。
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