Cell | REF1多肽是一种促进植物再生的局部创伤信号

REF1是一种与系统无关的促进再生反应的局部创伤信号，REF1的应用通过提高作物的再生能力来提高作物的转化效率。

实验结果：

1、REF1是一种促进再生反应的系统无关的局部创伤信号

2、REF1被受体PORK1感知，用于植物再生

3、REF1-PORK1通过激活主转录因子WIND1促进再生

4、REF1提供了一种提高抗性作物再生效率的简单方法

生物体经常暴露于广泛的生物和非生物胁迫中，造成严重的伤害，导致部分或完全的器官损失。在损伤后，植物和动物都能够再生出新的组织或器官，以最大限度地减少正常磨损的影响。与动物相比，植物受伤害的频率更高，并且已经进化出显著的再生能力，以修复受损的组织并再生新的器官或整个植物。因此，植物在受伤害后表现出不同的再生模式。

植物的内在再生能力为许多植物物种在受控条件下的体外繁殖和生产的各种生物技术程序提供了基本依据。鉴于创伤是启动自然和体外再生的必要前提，人们普遍认为，创伤刺激实际上可能为这一现象提供了主要的诱导触发因素。拟南芥模型的多项研究表明，关键的创伤激素茉莉酸盐在促进干细胞活化和根再生中起着关键作用。但几十年来，植物究竟将什么视为创伤信号以及局部创伤信号如何开始再生仍然未知。

作者一直使用番茄 (Solanum lycopersicum)作为遗传易处理的模式植物来识别诱导组织修复和器官再生的主要局部创伤信号。番茄损伤诱导型防御蛋白酶抑制剂为研究系统防御反应的机制提供了一个有吸引力的模型系统。考虑到再生和防御是植物创伤反应的相互关联的方面，作者推断再生信号缺陷的番茄突变体在对伤害的反应中既表现出受损的再生能力，也表现出受损的防御反应。在本研究中，作者发现系统发生缺陷的番茄突变体表现出正常的再生能力，这表明一定存在与系统无关的创伤信号，在调节组织修复和器官再生中发挥作用。

在本研究中，作者报道了番茄spr9突变体，该突变体以前被鉴定为原系统蛋白介导反应的抑制因子。基因克隆研究表明，SPR9基因编码SlPep前体，SlPep是植物激发子肽家族免疫调节肽的单一番茄同源物。作者发现，虽然SlPep前体基因或其受体基因的缺失会破坏伤愈伤组织形成和芽再生的再生能力，但这些基因的过表达会增强再生能力。此外，外源施加SlPep肽可显著提高再生能力。因此，将SlPep命名为再生因子1 (REF1)。多项证据表明，REF1信号通路通过激活SlWIND1来促进再生，SlWIND1是主细胞编程调节因子WIND1的番茄同源物。此外，SlWIND1通过对REF1前体基因的转录激活来放大REF1信号。因此，REF1作为局部创伤信号促进植物再生。REF1的发现为通过提高抗逆性作物的再生能力来提高其转化效率提供了一种便捷的方法。

1、SlPep是一个与系统无关的创伤信号，主要调节局部防御反应

根据系统肽及其前体基因系统素(PRS)主要调节系统防御反应的观点，CRISPR-Cas9介导的PRS敲除突变体和系统肽信号突变体spr1-1缺乏系统防御反应，但通过评估创伤诱导的蛋白酶抑制剂标记基因(PI -Ⅱ)在局部受损叶片和系统未受损叶片中的表达，维持了中间的局部防御反应。与上述主要缺乏系统性防御的系统相关突变体相比，spr9突变体在对创伤反应中表现出中度的局部防御和中度的系统性防御。

为了利用相同的群体定位SPR9基因，作者对从突变型或WT植株创伤反应表型的F2个体中获得的DNA进行了大量群体测序。预测被注释的基因Solyc04g072310编码SlPep前体基因PROPEP (PRP)，该基因与AtPROPEP6在系统发育上最接近。鉴于Pep家族免疫调节肽在调节植物创伤反应中的既定作用，作者开始验证PRP是spr9突变的致病基因的假设。事实上，spr9中PRP基因的基因组DNA测序显示，突变体携带C146缺失，导致过早终止密码子。

为了验证PRP是spr9创伤反应表型的致病基因，将WT PRP基因组DNA及其原生启动子引入spr9突变体。作者构建了crispr-cas9介导的prp空等位基因(prp)。prp植株的局部防御反应和全身防御反应与spr9突变体相似。总之，这些结果表明SPR9编码SlPep前体基因PRP。为了研究PRP和PRS在调节创伤诱导的防御反应中的遗传关系，作者构建了prp -2 prs -1双突变体，该突变体缺乏系统防御反应，与任何亲本突变体相比，其局部防御反应进一步降低，这表明PRP与PRS一起调节局部和全身防御基因的表达，以应对伤害。

与系统蛋白一样，外源施加SlPep肽可以诱导WT植株中PI-II的强表达。综上所述，上述结果支持了SlPep是一个系统独立的创伤信号，优先调节局部防御反应。先调节局部防御反应。

图1.SlPep是一个系统独立的创伤信号，主要调节局部防御反应 

2、SlPep是一个再生因素

由于SlPep和系统肽在调节局部和系统防御反应中具有叠加作用，使得作者研究这些免疫调节肽是否在创伤触发再生中发挥作用。为此，作者首先评估了在番茄常规组织培养中，PRS或PRP的缺失是否影响植株再生能力。WT和prs突变体的下胚轴外植体在愈伤诱导培养基(CIM)上产生大量的愈伤组织，并在芽诱导培养基(SIM) 上出芽再生。并且，与WT 相比，PRP-OE植株的再生能力显著提高。这些结果表明，SlPep前体基因在组织培养体系中对再生能力的获得起着关键作用。

作者接着探究SlPep肽段是否促进植株再生。首先，prp和spr9突变体的再生缺陷很容易被外源SlPep恢复。其次，SlPep以剂量依赖的方式提高了野生型植株的愈伤组织形成能力。总的来说，这些数据表明SlPep是一个再生促进因子。因此，下文将SlPep称为REF1。

图2.SlPep是诱导愈伤组织的再生因子

3、REF1诱导的再生依赖于PORK1

考虑到PEPR1和PEPR2是拟南芥Pep植物细胞因子的真正受体，作者研究了番茄PORK1是否参与REF1信号传导。CRISPR-cas9介导的PORK1空等位基因（pork1）在防御基因表达和根生长抑制试验中对系统蛋白完全敏感。相比之下，这些pork1突变体在防御基因表达和根生长抑制试验中对REF1不敏感。这些结果共同表明，PORK1介导REF1信号，而不是系统蛋白信号。

正如预期的那样，pork1突变体的愈伤组织形成和芽再生能力被破坏。相反，与WT相比，PORK1-OE植株的愈伤组织形成和茎部再生能力增强。此外，REF1也无法挽救pork1突变体有缺陷的再生能力。总之，这些数据支持REF1通过PORK1调控植物再生。

图3.REF1诱导的再生依赖于PORK1

4、PORK1是REF1的受体

PORK1由细胞外LRR结构域、跨膜结构域和细胞质激酶结构域（CD）组成。从烟草的叶片中表达和纯化的PORK1外结构域(PORK1Ecto)被拉下了生物素化的REF1，而不是生物素系统素。过多的非标记REF1竞争了生物素-REF1与PORK1Ecto的结合，表明REF1与PORK1之间存在特定的相互作用。然后，作者使用原生质体报告基因实验来检测PORK1是否可以介导ref1诱导的FRK1（LRR-RLK激活的早期标记基因）的表达。转染了PORK1的拟南芥原生质体于REF1，观察到pFRK1::LUC的显著诱导。剂量反应研究表明，表达PORK1的原生质体对亚纳摩尔浓度的REF1具有响应性，在~0.028 nM REF1时产生半最大刺激(EC50)。在平行实验中，SYR1对pFRK1::LUC的系统依赖性诱导发生，EC50为~0.031 nM，这与先前的观察结果一致，SYR1是系统蛋白的高亲和力受体。

体外磷酸化实验表明，PORK1的CD显示出激酶活性。假定的激酶结构域ATP结合位点(PORK1K845E)的突变使其激酶活性消失。在烟草中短暂表达时，PORK1具有自磷酸化活性，并且这种活性通过REF1的激发而不是系统蛋白的激发而增加。激酶失活的PORK1K845E消除了其激酶活性和对REF1的响应性。接下来，作者评估了PORK1对ref1诱导的MAPK/MPK活化的贡献。在表达pork1的烟叶中，REF1诱导了MPK3/6的磷酸化，而不是系统蛋白，而PORK1K845E不允许REF1触发的MPK3/6的激活。在REF1处理30分钟后，WT番茄幼苗的MPK3/6磷酸化显著增加。这种ref1诱导的MPK3/6磷酸化在PORK1 -3幼苗中几乎被消除，这支持了ref1诱导的MAPK激活依赖于PORK1。总的来说，作者的数据表明PORK1是REF1的受体。

图4.PORK1是REF1受体

5、REF1-PORK1信号通过激活SlWIND1表达促进再生

接着作者研究了ref1 - pork1介导的信号如何调节器官再生。考虑到WIND1在促进损伤诱导的细胞重编程中的功能在高等植物中是保守的，并且拟南芥WIND1可以诱导番茄的愈伤组织形成，作者研究了REF1是否以及如何诱导WIND1的番茄同源物SlWIND1的表达。利用pSlWIND1::GUS转基因植株，作者发现下胚轴出现创伤时SlWIND1启动子活性被诱导，并且这种诱导作用在REF1处理下得到增强。值得注意的是，RT-qPCR分析显示，prp-2和pork1-3突变体中创伤诱导的SlWIND1表达受损，这表明REF1-PORK1模块对创伤诱导的SlWIND1表达激活很重要。

为了检验SlWIND1在植物再生中的重要性，作者产生了slwind1和SlWIND1-OE株系，并在常规组织培养中检测了它们的再生表型。结果表明，slwind1突变体愈伤组织形成和茎部再生能力严重受损，而SlWIND1-OE植株的愈伤组织形成和茎部再生能力较WT增强，表明SLWIND1在番茄组织培养再生能力的获得中起着关键作用。此外，slwind1突变体受损的再生能力无法通过REF1修复。总之，这些结果支持REF1-PORK1信号通路通过激活SlWIND1表达促进创伤诱导的再生。

图5.REF1-PORK1信号通过激活SlWIND1表达促进再生

6、SlWIND1介导REF1信号的放大以响应创伤刺激

在确定REF1通过激活细胞重编程主调控因子SlWIND1促进再生后，作者研究了激活的SlWIND1反馈是否以及如何调节REF1信号。通过pPRP::GUS报告基因检测，REF1前体基因的启动子活性可以通过损伤下胚轴来诱导。此外，与WT相比，创伤和ref1介导的PRP表达诱导在SlWIND1-3突变体中被削弱，这表明SlWIND1在创伤触发的PRP表达诱导中起重要作用。与WIND家族蛋白优先结合VWRE的观察结果一致，EMSAs结果显示，SlWIND1-His重组蛋白结合了含有VWRE (50 -AAATTT-30)基序的DNA探针，但未能结合VWRE基序突变的DNA探针。同样，使用SlWIND1-GFP植物和GFP抗体进行的ChIP-qPCR检测显示，SlWIND1-GFP在PRP启动子的“B”区域高度富集。综上所述，这些结果表明SlWIND1通过启动子结合激活PRP表达。因此，REF1启动的SlWIND1激活正向反馈到REF1前体基因上，在再生过程中放大REF1信号传导。

图6.REF1和SlWIND1对创伤反应的正反馈调节

7、REF1提高了抗性作物的再生和转化效率

鉴于再生能力是遗传转化和基因组编辑的瓶颈，作者研究了REF1对几种抗逆性野生番茄再生和转化效率的影响。结果表明，应用REF1可使再生和转化效率分别提高19倍和12倍。在平行实验中，REF1可使LA1777的再生和转化效率分别提高5倍和6倍。

由于再生效率低，目前大豆的转化具有挑战性。为了评估GmREF1对大豆再生转化效率的影响，作者构建了35S::Q-FLAG载体和Q-CRISPR载体进行转化，Q基因编码一种参与共生关系的酶。结果表明，GmREF1使东农50的再生和转化效率分别提高了9倍和2倍（35S::Q-FLAG载体）。以及提高9倍和5倍（Q-CRISPR载体）。上述结果表明，GmREF1在常规基因转化和基因编辑中均能提高大豆的转化效率。

然后，作者将试验扩展到单子叶作物，包括小麦和玉米，这些作物在遗传转化方面表现不佳。为此，作者将一个Ubi::GUS构建体引入到一个难以转化的优质小麦品种JM22中。应用TaREF1可使JM22的再生和转化效率分别提高8倍和4倍。在玉米中，将Ubi::GFP结构转化为B104，结果表明，使用ZmREF1可使B104的再生和转化效率分别提高6倍和4倍。与其他通过表达发育调控因子促进B104转化的研究相比，应用外源ZmREF1肽促进B104转化是一种简单易行的方法。

总的来说，作者的数据表明，REF1可以提高包括双子叶和单子叶在内的多种难转化作物的再生和转化效率。

图7.REF1提高了抗性作物的再生和转化效率

植物经常受到创伤，并进化出一种非凡的再生能力来愈合创伤。然而，触发再生反应的创伤信号尚未被确定。在本研究中，作者通过对一个番茄创伤诱导防御和再生缺陷突变体的表征，证明了在番茄中，一种植物激发子肽(Pep)，再生因子1 (REF1)，作为一个系统无关的局部创伤信号，主要调节局部防御反应和再生反应，以应对创伤。作者进一步发现PEPR1/2同源受体样KINASE1 (PORK1)是植物再生中感知REF1信号的受体。REF1 - PORK1介导的信号通过激活创伤诱导的去分化1 (WIND1)来促进再生，WIND1是植物创伤诱导的细胞重编程的主要调节因子。因此，REF1-PORK1信号代表了一个保守的植物细胞因子通路，可以启动、放大和稳定一个信号级联，协调创伤触发的器官再生。REF1的应用为提高抗逆性作物的再生转化效率提供了一种简单的方法。