1. 杂种二代株系成熟期果肉中AsA含量与MdGLDH的表达量及花青苷含量均显著正相关
研究者从团队前期构建的新疆红肉苹果杂种二代分离群体中随机选取了15个红肉与15个非红肉苹果(图1a)，对它们成熟期果肉中的AsA含量(图1b，c)和MdGLDH的相对表达水平(图1d，e)进行了分析。结果表明，红肉苹果果肉中AsA含量与MdGLDH的相对表达量均显著高于非红肉苹果(P < 0.01)。相关性分析揭示了AsA含量和MdGLDH表达量之间的强正相关性(r = 0.94，图1f)。此外，研究者对随机选取的30个苹果果肉中的花青苷含量进行了测定，并分析了其与AsA含量的相关性。结果表明，红肉苹果果肉中的花青苷含量同样显著高于非红肉苹果（P < 0.01；图1g，h）。相关性分析发现，AsA含量与花青苷含量呈正相关(r = 0.90，图1I)。这些结果表明，杂种二代株系成熟期果肉中的AsA与花青苷含量呈正相关，且MdGLDH可能是果肉中AsA合成的关键因子。
图1 杂种二代株系成熟期果肉中AsA含量与MdGLDH的表达量及花青苷含量
均显著正相关
2. MdCPCL与MdGLDH的启动子结合并激活其转录
以MdGLDH的启动子为诱饵，通过酵母单杂交(Y1H)文库筛选技术，鉴定出一个R3型MYB转录因子MdCPCL。对MdGLDH启动子序列中的顺式作用元件分析发现，该启动子存在4个MYB转录因子的结合原件 (图2b)，凝胶迁移实验(EMSA)结果证实MdCPCL与其中两个MBS顺式元件结合(图2c)。进一步分析表明，在竞争性探针存在下，MdCPCL和MdGLDH启动子之间的结合强度降低，当用突变探针替换标记探针时，检测不到MdCPCL和MdGLDH启动子之间的结合(图2d，e)。荧光素酶报告实验(LUC)分析发现，MdCPCL显著激活MdGLDH的启动子并增强其转录(P < 0.05；图2f，g)。此外，ChIP-PCR与ChIP-qPCR的结果也证明了两者的结合，含有MBS顺式元件的MdGLDH的启动子片段在MdCPCL-GFP的转基因‘王林’愈伤组织中富集(图2h，I)。这些结果表明，MdCPCL能够直接与MdGLDH启动子上的MBS元件结合并激活其转录。
图2 MdCPCL与MdGLDH的启动子结合并激活其转录
3. 过表达MdCPCL促进苹果中AsA和花青苷的合成
由于MdCPCL绑定MdGLDH的启动子并促进其表达，研究者猜测MdCPCL可能参与AsA的合成。为了验证上述猜测，研究者获得了三个独立的稳定过表达的转基因‘王林’ 愈伤组织和三个独立的被CRISPR/Cas9敲低的转基因红色愈伤组织（图3a）。通过PCR扩增、蛋白印记分析和测序结果鉴定证实了转基因的存在（图3b，c，d）。与对照愈伤组织相比，过表达MdCPCL的愈伤组织中AsA与花青苷含量显著增加（P< 0.05；图3e，f），RT-qPCR分析表明，MdCPCL和MdGLDH的相对表达量同样显著增加（P < 0.05；图3h，j）。当MdCPCL被敲低后，结果相反（图3e，g，i，k）。此外，由于过表达MdCPCL还促进了愈伤组织中花青苷含量的增加，为进一步验证MdCPCL在苹果果实中的生物学功能，研究者进行了苹果瞬时注射实验。结果表明，MdCPCL过表达增加了MdGLDH、MdANS与MdUFGT的转录水平，导致AsA和花青苷在渗透部位周围大量积累，果实红色增加（图3l，n，o）；相反，抑制MdCPCL的表达降低了MdGLDH、MdANS与MdUFGT的转录水平，导致渗透部位周围的AsA和花青苷含量降低，果实红色减弱（图3m，p，q）。这些结果表明，MdCPCL在AsA和花青苷积累中具有积极的调节作用。
图3 过表达MdCPCL促进苹果中AsA和花青苷的合成
4. MdCPCL直接与花青苷合成途径的结构基因MdANS的启动子结合并激活其转录
鉴于过表达MdCPCL愈伤组织中MdANS和MdUFGT的表达量显著增加，研究者推测MdCPCL同样与MdANS和MdUFGT的启动子结合。Y1H实验(图4a，b)发现了MdCPCL只结合MdANS的启动子。对MdANS的启动子进行分析，发现其启动子序列包含两个MYB转录因子识别元件(图4c)，进一步通过EMSA，ChIP-PCR和ChIP-qPCR确定了MdCPCL绑定MdANS启动子上的MBS（TAACCA）元件（图4d，e，h，i，j）。LUC分析表明，MdCPCL可以显著激活MdANS的启动子并促进其转录（图4f，g）。这些结果表明，MdCPCL能够直接与MdANS启动子上的MBS元件结合并激活其转录，进而参与花青苷的合成。
图4 MdCPCL直接与花青苷合成途径的结构基因MdANS的启动子结合并激活其转录
5. MdCPCL-MdILR3L复合物加强AsA与花青苷的积累
在‘王林’愈伤组织中共转化了MdCPCL与MdILR3L，获得了三个独立并稳定的转基因愈伤组织（图5a），使用不同的标记抗体（图5b）及RT-qPCR分析验证了转基因的存在（图5e，f，g，h）。在光照培养下，共转化的转基因愈伤组织比单独过表达MdCPCL的愈伤组织积累了更多的AsA和花青苷含量（图5c，d），这表明MdCPCL-MdILR3L复合物加强了愈伤组织中AsA和花青苷的积累。EMSA进一步阐明了该复合物对MdGLDH和MdANS启动子的影响(图5i，j，k)，添加MdILR3L-GST后，MdCPCL与MdGLDH和MdANS启动子的结合强度显著增加，结果表明，MdCPCL和MdILR3L形成复合物，能增强后续与下游基因的结合。此外，荧光素酶报告实验表明，proGLDH/proANS::LUC与35S::CPCL + 35S::ILR3L共表达的发光强度比proGLDH/proANS::LUC + 35S::CPCL单独表达的发光强度更大（图5l，m，n，o）。这些结果表明，MdCPCL与MdILR3L相互作用能够促进下游关键基因的转录，加强AsA和花青苷的积累。
图5 MdCPCL-MdILR3L复合物加强AsA与花青苷积累
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