电子显微镜以其卓越的分辨率，为我们揭示了光镜下无法捕捉的生物样品细节。但为了更好地利用这一强大工具，理解不同的生物电镜成像方式及其相应的样品制备流程至关重要。本文为您梳理了几种常见的生物电镜成像方式，和对应的基本制样流程。
对样品表面形貌进行观察时
01
临界点干燥法
适用范围
适合大部分生物样品的表面成像。
基本制备流程
取材-清洗-固定-脱水-临界点干燥-粘样喷金
▲ 血小板细胞
02
自然干燥法
适用范围
本身就较干燥的样品，如某些昆虫、植物种子、毛发、牙齿等。
基本制备流程
取材-自然干燥-粘样喷金
▲ 硅藻，图像添加伪彩
03
冷冻扫描电镜制样
适用范围
对内部含水多而表面含水少的样品进行快速制备成像。
*冷冻扫描电镜法制样简便速度快，样品更接近自然生理状态，并且可以使用冷冻断裂的方式对样品内部结构进行观察。
基本制备流程
取材-液氮冷冻-冷冻转移-升华-喷金
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对样品内部超微结构进行观察时
01
常规超薄切片制样
适用范围
当需要对单张超薄切片进行超微结构成像时最常用的制样方法。
单张超薄切片可以使用透射电镜、扫描电镜的背散射电子探测器或扫描透射电子探测器进行观察，在亚细胞结构成像的水平上，成像效果相差不大。
基本制备流程
取材-染色固定-脱水-渗透包埋-切片-后染色
▲ 小鼠脑组织，使用STEM扫描透射电子探测器拍摄
02
体电镜制样
适用范围
当需要对一定体积的组织进行逐层成像时使用的制样方法。
*近些年来随着扫描电镜技术的不断发展，三维电镜成像变得越来越简便化、自动化，也受到人们越来越多的关注。体电镜样品制备可以提高样品块的衬度和导电性，更加适合直接对样品块进行成像的体电镜应用。
基本制备流程
取材-固定-双锇染色-脱水-渗透包埋-修块成像
▲ 点击播放小鼠脑组织视频
针对不同的样品和不同的成像目标，生物电镜制样方法多种多样，并可能需要根据具体情况对制样方法进行调整。但是制样操作基本步骤的一些基本原则和注意事项是共通的。
取材：取材的好坏直接决定了最终成像的结果，一定要打起12分的注意。
准 样品尽量新鲜，取材部位准确;取材部位解剖水平的准确定位要求误差应≤1mm
快 样品在离体后以最快的速度浸入初固定液
小 取材标本粒径必须与固定液的固定能力相适应，一般以1mm3的粒径为宜
轻 解剖用具要锋利，动作要轻巧，避免机械牵拉
冷 生理温度固定，低温操作, 避免细胞自溶
固定：对样品进行充分而合适的固定可以稳定组织细胞中的各种成分，让超微结构在后续的处理步骤中得到更好的保留。
通常使用醛类化合物（戊二醛、多聚甲醛）和锇酸对样品进行固定
固定剂要足量，使样品充分浸没在固定液中
根据样品情况选择合适的缓冲液，并对溶液进行pH值和渗透压的调节
漂洗：各步骤之间漂洗要充分，防止化学试剂间发生反应形成沉淀。
脱水：通常使用乙醇和丙酮进行逐级脱水，根据样品情况对脱水的梯度和时间进行调整，注意保证样品脱水要彻底。
渗透包埋：在脱水剂中逐步提高树脂的浓度，使树脂缓慢浸入样品，最终完全替代脱水剂，在合适的条件下使树脂聚合硬化，可以根据应用需求对树脂配方进行调整以实现不同硬度的包埋效果。
染色：为了增加样品成像的衬度，可以在包埋前对样品块进行染色，也可以对超薄切片进行后染色。通常使用的染色试剂包括乙酸双氧铀、柠檬酸铅、天冬氨酸铅等，要注意试剂的配置和过滤以免发生重金属沉淀。
*需要对样品进行表面形貌观察时还要注意：
清洗：固定前要充分去除样品表面的黏液和污物，暴露样品表面的微细结构。
临界点干燥：目前的临界点干燥仪大部分为半自动或全自动仪器，操作时注意严格遵守操作规程。样品干燥后取放要轻柔，防止造成样品破损。
今年5月，蔡司协同华东师范大学举办了生物电镜样品制备技术交流会，倪兵老师和王奕文老师分别对扫描电镜和透射电镜样品制备进行了详细的讲解，梳理了样品制备的基本流程和注意事项，还为大家分享了多年制样积累的经验，干货满满。两场报告内容现已更新，欢迎大家点击下方查看。
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