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随着测序成本的不断降低，重测序分析得到的性状关联SNP，如何开展研究，这篇文章很值得参考。近日，中国农业大学园艺学院张小兰教授团队联合河北科技师范学院闫立英教授和东北农业大学辛明研究员在The Plant Cell杂志在线发表题为Single nucleotide polymorphisms in SEPALLATA 2 underlie fruit length variation in cucurbits的研究论文，通过GWAS分析，基因定位，RNA-seq、ChIP-seq、EMSA等技术解析了MADS-box家族转录因子SEPALLATA 2 (SEP2) 调控葫芦科作物果实长度变异的分子机制。爱基百客为本文提供了ChIP-seq技术服务。
大多数必需基因对植物生长发育有着多效作用，关键基因的完全破坏通常伴随着严重的生长和发育缺陷，对于基因编码区和非编码区的单核苷酸多态性（SNP）和InDels等细微变化有望打破上述限制。因此，通过鉴定和控制特定有利性状的关键基因的SNP对于作物育种具有重要意义。
SEPALLATA (SEP)属于MADS-box家族转录因子，E类基因，通过与异四聚体形式的ABC 类蛋白相互作用来控制花器官特性（A类基因：单独作用时控制萼片的发育，在与B类基因共同作用时控制花瓣的发育。A类基因的突变会影响萼片和花瓣。B类基因：在与A类基因共同作用时决定花瓣的发育，在与C类基因共同作用时决定雄蕊的发育。B类基因的突变影响花瓣和雄蕊。C类基因：单独作用时控制心皮的发育，在与B类基因共同作用时控制雄蕊的发育。C类基因的突变影响心皮和雄蕊。E类基因：在花器官发育中起着重要作用，与A、B和C类基因形成四聚体，作为“花四聚体模型”的粘合剂。E类基因的表达对于花分生组织的确定性以及花器官特征属性的决定至关重要）。
在花的ABC类基因的基础上，后来研究者提出了ABCDE模型，其中E类基因的发现补充了ABC模型，解释了更多花器官发育的现象。例如，在拟南芥中，SEPALLATA（SEP）基因作为E类基因，与其他类别的MADS-box基因协同作用，共同决定花器官的发育。E类基因在花原基发育过程中的表达模式存在差异，可能与花器官的多样性有关）。SEP在花卉发育中的功能已被证明在不同物种之间有着广泛保守性。然而，迄今为止，尚未有报道SEPs基因的自然变异。黄瓜(Cucumis sativus)、甜瓜(Cucumis melo)、西瓜(Citrullus lanatus) 和南瓜(Cucurbita spp.) 等葫芦科植物果实大小变化巨大。黄瓜作为一种世界各地均有种植的代表性葫芦类蔬菜作物，其果实长度调控已经有一定深入研究，目前已鉴定出调节黄瓜的果实大小14个相关QTL。其中，仅克隆了3个QTL（FS1.2、FS2.1、FS5.2）候选基因，还有很多基因有待探究。本研究中作者在E类基因CsSEP2 中发现了两个特异性调控黄瓜果实长度的SNP，并进一步探究CsSEP2的SNP变化通过直接抑制黄瓜中的CsCRC转录，导致果实长度变化。此外，在CmSEP2上发现了一个7638G/A的SNP，它通过甜瓜中保守的SEP2-CRC模块来调节果实长度。
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为了鉴定调控黄瓜果实伸长相关基因，作者收集了全球191个黄瓜种质进行了全基因组关联研究 (GWAS)，其中包括10个印度(IND)黄瓜种（一个野生种和9个IND地方品种）、5种半野生西双版纳品种（XIS）、113个栽培东亚品种（EA）和63种栽培欧亚品种（EU）。这些种质成熟时的果实长度从5~100厘米不等（图1A）。黄瓜GWAS分析显示4号染色体上的10kb连锁不平衡（LD）模块中存在SNPA/T（chr4_7886522，P=8.1×10-7）与果实长度显著相关（图1B-C）。该区间中有一个CsaV3_4G010090基因，属于SEP1/2亚家族，命名为CsSEP2。位于CsSEP2第四个外显子的SNPA/T导致氨基酸从谷氨酸(E)变为缬氨酸(V)，其中CsSEP22667A和CsSEP22667T分别与短果和长果相关(图1D-E）。IND黄瓜仅具有CsSEP22667A等位基因，而CsSEP22667T等位基因主要存在于栽培的EA组中（图1F）。值得注意的是，EA的平均果实长度比其他三组更长（图1G）。为了进一步探究CsSEP2的选择足迹，作者分析了四个黄瓜组中CsSEP2及其上游3kb启动子序列的核苷酸多态性(π)。结果显示，CsSEP2在EA中表现出急剧降低的π（图1H），这表明CsSEP22667T在黄瓜驯化和提高果长过程中被选择出来。
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图1 GWAS分析与黄瓜果实长度相关基因CsSEP2
CsSEP22667A/T在四个NILs背景中与果实长度表型出现共分离为了验证CsSEP22667A/T调节果实长度的自然变异，作者选择了两个极端果实长度种质#199（携带纯合CsSEP22667T等位基因的长果）和#65（携带纯合CsSEP22667A等位基因的短果）通过标记辅助回交获得NIL群体。与#199AA相比，#199TT的果实长度在所有阶段均显着延长，包括开花日（0DAA，花后第二天）、（10DAA）和成熟阶段（图2A-B)。在10DAA时，#199TT的果实长度比#199AA增加了17.5%。同样，与#65AA相比，#65TT的果实长度在所有阶段均显著延长（图2F-G）。成熟阶段NIL中果皮的纵向切片显示，与#199AA和 #65AA相比，#199TT和 #65TT中存在显著增大的细胞（图2C-D，H-I），这意味着CsSEP22667A/T通过细胞扩张伸长来调节果实长度。然而，#199和#65NIL中CsSEP2的表达水平并未有改变（图2E、J）。在天然黄瓜种质中，未发现CsSEP2表达水平与果实长度之间存在相关性（图2K），这说明黄瓜中介导果实伸长的CsSEP2的SNP变化影响比其基因自身表达水平大。
为了进一步验证CsSEP22667A/T在黄瓜果实长度变异中的作用，作者鉴定了两个CsSEP22667A/T杂合的材料（#138和#4）。#138AT种质平均含有38,495个杂合SNP，#4AT种质约41,582个，占全基因组的不到1%。因此，自交分离群体可以被视为CsSEP22667A/TNIL。通过测量三个阶段的表型数据，#4TT和#138TT中的果实长度显著长于#4AA和#138AA，同时细胞尺寸增大且CsSEP2表达不变（图2L-U)，进一步支持CsSEP22667T等位基因通过促进黄瓜细胞扩张来促进果实伸长。图2 四个黄瓜CsSEP22667A/CsSEP22667TNIL系与黄瓜果实长度为了进一步验证CsSEP2在黄瓜中的功能，作者在XTMC（携带纯合CsSEP22667T等位基因的长果）和Poinsett 76 (PS76)（携带纯合164 CsSEP222667A等位基因的短果）中过表达加flag标签的CsSEP22667A 和CsSEP22667T。与WT相比，CsSEP2表达量增加了2-3倍，WB显示使用Flag抗体可检测外源CsSEP2蛋白（图3A-B）。CsSEP2过表达株系果长在三个阶段都没有发生变化，进一步支持果长变化是由SNP引起而不是基因表达量。CsSEP2在花和果实等生殖器官中高表达（图4A），令人惊讶的是，CsSEP过表达系很可能形成共抑制系，其中4种CsSEP基因的表达水平均出现不同程度的显著下降（图4B）。共抑制系中的花器官包括萼片、花瓣和雄蕊明显变大（图4C-F、L）。花柱变长，柱头向外翻转（图4G，L）。共抑制株系中雌花结出的果实畸形，严重开裂（图4H-I），而雄花中的心皮原基继续发育，形成异常的球形果实（图4J-K）这些表型与之前报道的外显子跳跃Cssep2突变体相似，表明CsSEP2功能丧失会导致严重的花发育表型，而CsSEP2的SNP变化影响黄瓜的果实长度变化。
图3 过表达CsSEP2基因对黄瓜果长无影响
图4 黄瓜过表达CsSEP2及CsSEP共抑制系的鉴定使用EMS诱变含有纯合CsSEP22667T等位基因的黄瓜自交系6457，获得long fruit 1(lf1) 突变体，具有细长的果实（图5A、C）。WT商业期果长为24.3±1.6cm，lf1为33.5±3.1cm，果长增长37.8%。lf1果实中果皮的纵向切片显示细胞大小显著增加（图5B、D）。通过将lf1与WT杂交构建了F2群体。F1代果实长度与WT相似。在234个个体的F2群体中，55株表现出长果性状，而其余179株表现出与WT相似的果实长度。分离模式符合3:1的孟德尔比率，表明lf1是由单个隐性基因控制的。
为了探寻克隆得到候选基因，作者对来自F2群体的两个亲本、26个长果个体和29个短果个体的基因组DNA样本进行了BSA测序分析。连锁分析lf1位点限定在12.7Mb区间，锁定SNP4G7889181和SNP4G14088424的两个候选位点，其中只有SNP4G7889181与长果表型共出现分离（图5E）。有趣的是，SNP4G7889181（G to A）位于CsSEP2基因内（CsSEP28G/A）（图5F）。G到A的突变导致精氨酸 (R) 变为赖氨酸 (K)，位于单子叶植物和双子叶植物中高度保守的MADS结构域中（图5G）。WT和lf1突变体之间的CsSEP2表达没有差异（图5H）。CsSEP2通过抑制黄瓜中CsCRC的表达来调节果实长度
为了探索CsSEP2的SNP调节果实长度的分子机制，作者选择两个过表达系CsSEP22667A-XT和CsSEP22667T-XT，通过ChIP-seq鉴定CsSEP2的潜在结合位点。同时，在WT和lf1中进行了RNA-seq以探索下游基因。结果显示，在两个ChIP-seq数据和RNA-seq数据中，只有8个基因是共同的（图6A）。有趣的是，先前报道的主要效应果实长度调节因子CsCRC是最常见基因之一（图6B），其在lf1表达量是野生型的4.6倍。通过RT-qPCR在NILs中进一步验证CsCRC的表达。结果显示，在4个含有纯合CsSEP22667T等位基因（长果实）的近等基因系中，CsCRC的表达水平显著高于含有纯合CsSEP22667A等位基因（短果实）的近等基因系（图6D），这与之前报道的CsCRC在果实长度变异中的积极作用一致。
考虑到GWAS鉴定的2667A/T-SNP位于K-domain，而诱变产生的8G/A-SNP位于MADS结构域（突变体黄瓜中的2667-SNP为T），将CsSEP2分为三种单倍型，其中HAP1（8G2667A）和HAP2（8G2667T）分别对应短果和长果。HAP3（8A2667T）是通过EMS诱变诱导的进一步伸长的果实（图6C）。根据ChIP-seq结果，在CsCRC中确定了两个潜在的SEP2结合位点（SBS）：SBS1和SBS2（每个位点包含一个CArG-box）。利用EMSA实验研究不同CsSEP2单倍型蛋白与CsCRC DNA结合的能力。结果表明，CsCRC：SBS与同型二聚体CsSEP2结合。同源二聚体HAP 1、2、3对SBS的亲和力逐渐减弱（图6E）。CsSEP2对体内CsCRC的转录调节作用。结果显示HAP 1、2、3对CsCRC表达的抑制作用逐渐降低，HAP3几乎没有抑制作用（图6F）。构建CsSEP2与酵母转录因子GAL 4的DNA结合结构域之间的融合蛋白用来比较HAP1-3的转录活性，结果显示，HAP1-3的融合蛋白之间没有差异（图6G），表明HAP1-3果实长度的增加是由于降低了对CsCRC转录的抑制作用所致。众所周知MADS结构域介导DNA结合，MADS结构域中保守氨基酸的变化会影响蛋白质与DNA的结合，如HAP3中那样。K-domain负责蛋白质结合作用，因此我们对HAP1（E132）和HAP2（V132）中具有E132V变体的K-domain进行了结构预测。HAP1和HAP2的IpTM得分分别为0.82和0.83，表明建模可靠性高。在HAP1中E132和R139之间存在极性连接（图6H）。当HAP 2中该位点突变为V132时，极性连接消失。两个亚基之间具有极性接触的氨基酸的总数也从HAP1中的18个减少到HAP2中的12个（图6I），表明E132V变体改变了SEP2的蛋白质二聚体的相互作用，因此可能间接影响与DNA的结合。图6 CsSEP2直接抑制黄瓜中CsCRC的转录
为了检测SEP2-CRC模式是否也存在于其它葫芦科物种中，作者首先检测了甜瓜CmSEP2（MELO3C026300）和西瓜ClSEP2（Cla97C07G143010）是否对它们各自的CRC具有转录调节作用。结果显示CmSEP2和ClSEP2均可抑制CRC表达，与黄瓜中的数据相似。接下来，作者在西瓜和甜瓜的天然群体中搜索了SEP2编码区中的共同SNPs，发现2个SNPs分别存在于甜瓜CmSEP2的MADS-结构域（14T/G-SNP，73%）和C-端（7638G/A-SNP，46%）中。256基因型和表型之间的相关性分析显示，仅位于C端的7638G/A-SNP与果实长度相关，其中CmSEP27638G、CmSEP27638A分别与短果实和长果实相关（图7A-B）。自然群体中CmSEP2单倍型仅有3种，分别为HAP1（14T7638G）、HAP2（14G7638G）和HAP3（14G7638A）（图7C）。转录活性分析显示，与CmSEP2HAP3相比，CmSEP2HAP1和CmSEP2HAP2均显示出对CmCRC的显著转录抑制，而在CmSEP2HAP1和CmSEP2HAP2之间未检测到差异（图7D），这与CmSEP2HAP3中的果实长度长于CmSEP2HAP1和CmSEP2HAP2的表型数据相一致，表明只有C端中的7638G/A-SNP调节甜瓜中的果实长度（图7A-B）。接下来，作者对CmSEP2及其邻近区域进行了核苷酸多态性（π）分析。作者将甜瓜为四组，包括93个野生型agrestis（WA）、377个栽培种agresti（CA）、34个野生melo（WM）和661个栽培melo（CM），结果表明，CA中CmSEP2的π值显著降低，表明其在栽培的长果农作物型甜瓜中被选择（图7E）。因此，SEP2-CRC模块在调节葫芦科植物果实长度方面具有一定的保守功能。
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作者利用GWAS分析鉴定到黄瓜果长CsSEP22667A/T-SNP，通过回交、表型分析、基因表达量确定果长与此SNP相关，与此基因表达水平无关（细胞伸长）；通过对纯合CsSEP22667T进行EMS诱变得到长果突变体lf1，将lf1与WT杂交构建了F2群体，进行BSA分析，又锁定到SNP4G7889181（G to A）位于CsSEP2基因内的突变（CsSEP28G/A）。后续通过ChIP-seq、RNA-seq进一步探究发现SEP2-CRC调控模块，且此调控形式在甜瓜中也具有，证明其存在一定保守性。整个研究从GWAS中找到的SNP出发，到探究到其调控果长的机制，值得做完GWAS找到那个天选SNP的研究者借鉴，同时也很感谢作者选择爱基百客做ChIP-seq，让我们也能为此研究出一份力。
· 爱基百客王牌产品ChIP-seq简介 ·
ChIP-seq技术将染色质免疫共沉淀和二代测序技术结合，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，可用于组蛋白修饰、RNA聚合酶、转录因子和辅因子以及G4链体（G4）等方面的研究，技术成熟稳定。爱基百客ChIP-seq可提供：Peak分析: Peak注释和分布分析，Peak关联基因的GO、KEGG的注释和富集分析， 转录因子和Motif分析等。
多样本差异分析：差异 Peak 分布情况统计，差异 Peak 关联基因GO、KEGG 功能注释与富集，转录因子预测，Motif 预测等。
· 后续验证
01 ChIP-qPCR
分析组蛋白修饰/转录因子与染色质区域的结合情况，揭示染色质状态和基因表达调控之间的关系，真实反映结合特性。基于DNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中的迁移率不同，检测活化的与DNA结合的蛋白转录或调节因子。检测转录因子与靶启动子的特异结合。
ChIP-seq和转录组关联分析可以做以下2个方面的研究：1、DNA结合蛋白和基因表达调控：通过ChIP-seq技术可以确定DNA结合蛋白（如转录因子）的结合位点，然后与转录组数据结合分析，可以获得转录因子直接调控的靶基因，为全面理解转录因子调控功能提供依据。2、组蛋白修饰和基因表达：ChIP-seq可以用于鉴定组蛋白修饰的位点，结合转录组数据可以了解这些修饰对基因表达的影响。· 爱基百客ChIP-seq三大优势
优势一：项目经验丰富，研究物种200＋种，累计实验2000余次。全面覆盖医口和农口等不同样本，不惧特殊样本（如脂肪组织、高淀粉组织和真菌类），抗体经验也极其丰富（多种组蛋白修饰、转录因子、标签抗体以及p300和RNApol II等均有涉及）；
优势二：提供前期实验设计、测序、分析以及后期验证（ChIP-qPCR、EMSA）一站式服务；优势三：项目文章多次发表于Science、Cancer Cell、Nature Plants、Nature Metabolism以及Plant Cell等期刊。
