在前期的文章中我们已经介绍了很多关于核酸和蛋白质之间互作的验证方法，那么如何证明蛋白和蛋白之间存在相互作用呢？蛋白质作为生命活动的主要承担者，其功能的发挥往往依赖于与其他蛋白质的相互作用，蛋白与蛋白的互作验证对于理解蛋白质功能、疾病发生机制以及药物研发具有重要意义。今天我们就来介绍3种关于蛋白与蛋白互作的验证实验，分别是Co-IP、GST pull-down和酵母双杂交。
免疫共沉淀（Co-IP）
1.1 实验原理
1.2 实验流程
GST pull-down
2.1、技术原理
为了提高Pull-down技术的效能，我们可以将要纯化的蛋白以融合蛋白的形式进行表达，即将“诱饵”蛋白和一种易于纯化的配体蛋白结合。1988年Smith等研究者利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）作为融合标签，从细菌中纯化出GST融合蛋白。GST pull-down技术，即GST融合蛋白沉降法，其原理是利用谷胱甘肽亲和树脂将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化，使其作为与目的蛋白亲和的支撑物，扮演“诱饵蛋白”的角色。当含有目标蛋白的溶液过柱，可以捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（即目标蛋白）。然后，通过SDS-PAGE电泳分析洗脱结合物，可以验证两种蛋白间的相互作用，或筛选相应的目标蛋白。
2.2 实验流程
常用术语：Input：全细胞裂解液，诱饵蛋白与靶蛋白表达的检测确认。Pull-down：即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。GST、His均为蛋白标签。
结果解读：GST的N端融合GmPSMD蛋白，在GmPIB1蛋白添加His标签便于免疫印迹。
Input + GST/His IB组：表示不经过GST pull down实验，直接对实验前各组的混合体系用GST或者His抗体进行免疫印迹，是阳性对照组表明各组有GST或者His相关组分。
Pull down+GST IB组：表示GST pull down实验后用GST抗体进行免疫印迹。发现两组均有条带，表明GST pull down实验体系可以正常发挥功能，也表明各组体系中含有GST相关的组分。
Pull down+His IB组：表示GST pull down实验后用HIs抗体进行免疫印迹。发现GST + GmPIB1-His组无条带，表明GST pull down体系中的GST空载与GmPIB1-His之间无互作，是阴性对照组。GmPSMD-GST + GmPIB1-His组有条带，表明两种蛋白之间存在互作。
酵母双杂交
3.1 技术原理
酵母双杂交技术原理
3.2 实验流程
目的基因克隆或目的基因合成；限制性内切酶酶切骨架载体并纯化；目的基因插入骨架载体；转化大肠杆菌，筛选阳性克隆并测序鉴定；
将目的AD载体与BD载体共同转化到酵母细胞中；
将共转的酵母细胞均匀涂布在二缺板(SD/-Leu/-Trp)上培养；
将二缺平板上生长的酵母单克隆影印至三缺板(SD/-His/-Leu/-Trp)和四缺板(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)上培养；
通过观察酵母生长情况和报告基因的活性，判断两个蛋白质是否相互作用。
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