植物根系分泌物-功能微生物组互作研究的实验模型

根系分泌物是介导宿主-根际功能微生物互作的重要介质，已经证实植物可以主动调控根系分泌物-功能微生物组之间的互作来维持微环境中的微生物稳态。然而，关于根系分泌物如何调节功能微生物组组和维持根际微生境中的微生物稳态仍然知之甚少。为此，中国科学院西双版纳热带植物园研究人员近期提出了一种植物根系分泌物-根际功能微生物互作研究的新模型，该模型基于前期发现藤蔓植物气生根黏液富含碳水化合物介导固氮功能微生物互作和稳态维持的基础上（Pang et al., 2023， Microbiome），寻找具有这一特殊和典型的禾本科植物的根系分泌物-功能微生物互作现象，提出气生根黏液-功能微生物作为植物功能基因-根系分泌物-功能微生物组的根际互作研究的新模型，并就宿主（代谢物）-功能微生物（及保卫微生物）-环境（病原）微生物间的稳态维持机制提出假设。该模型或有助于加深对根系生物学功能与根际微生物稳态维持的见解，相关研究成果于2024年11月在线发表在微生物学著名期刊《The ISME Journal》上。

1）根系分泌物能够介导宿主与环境微生物的相互作用、塑造根际功能微生物以促进宿主生长；

2）各种气生根植物分泌富含碳水化合物的黏液代谢物，能够“喂养”特定的固氮功能微生物组以宿主植物生长；

3）根系分泌物如何塑造与调控功能微生物组及维持微环境的微生物稳态仍然知之甚少；

4）为了研究植物功能微生物组的调控机制和根际微环境的微生物稳态的维持，研究者提出了一种新的以禾本科植物为主的气生根黏液-功能微生物组互作系统，作为研究根系分泌物和功能微生物组之间相互作用机制的模型。

1. 气生根黏液根黏液是一种典型的根系分泌物

气生根与地下根系生物学功能类似，此外还具有呼吸、光合等根系生物学功能。气生根尖分泌少量黏液可以保护根尖细胞，帮助植物进入土壤或攀爬、依附于其他植物/支撑界面。作者在西双版纳周边发现了4种以禾本科植物为主的不同的单子叶和双子叶植物具有气生根黏液现象，这些植物的气生根分泌大量的黏液代谢物但却没有进入土壤或接触/攀援到支撑物（图1a）。这种气生根黏液约离地面13-140 cm的植物茎上发育而来，长度从0.1-20 cm不等。最近，多项有趣的研究表明，气生根黏液含有丰富的初级和次级代谢产物，如包含约78.4%的多糖，7.3%的蛋白质，5.6%的矿物质和3.1%的脂质[14]。特别是禾本科中玉米和高粱的黏液中也富含碳水化合物、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和特殊的黏聚多糖（图1b），以及研究者前期对双子叶植物（蔓性野牡丹）的研究也表明黏液富集了黄酮类和糖类。同时，作者还发现气生根黏液与地下根系分泌物化学组成显著不同，根系分泌物中富集了更高含量的脂类、生物碱和酚酸（图2c、附图1和附表1）。然而，气生根黏液这一特殊生态位的生化组成尚未得到深入的分析和研究。

气生根黏液富含大量的碳水化合物和其他代谢物，为微生物活动和其他生物学过程提供充足的碳源、营养物质、湿润环境和保护性的屏障。此外，黏液中高碳低氧的微环境意味着该系统可能涉及宿主-微生物互作和生物固氮过程。此前研究发现气生根-黏液系统可以固定大气氮素（生物固氮过程）从而促进多种植物的生长。因此，这一富含碳水化合物的气生根黏液特殊生态位组成与功能不同于地下根际，可能与新的生物学功能有关。在这项工作中，研究者讨论了特殊气生根黏液的新的生物学功能和维持机制，并为根系分泌物及其功能微生物组之间的互作提供了新的见解。

2. 气生根黏液定殖着类似的功能微生物组

在此之前，来自于墨西科玉米中前沿和系统性的研究揭示了气生根黏液中富集Raoultella、Klebsiella、Azospirillum等细菌。一系列基于扩增子测序和微生物培养的研究也表明不同栖息地植物黏液微生物组的群落结构是类似的，比如都富集了潜在的固氮菌，如高丰度的克雷伯氏菌Klebsiella、草螺菌Herbaspirillum、微杆菌Microbacterium和固氮螺菌Azospirillum。这些固氮菌被广泛用作研究植物联合固氮菌的模式菌株，并在农业生产中得到了很好的应用。此外，利用微生物组功能注释、固氮能力检测和分子生物学等证据，综合全球范围内其他禾本科植物的研究发现类似的黏液固氮菌和气生根-黏液系统均可以帮助宿主固氮并促进宿主生长。这种气生根黏液富集潜在固氮微生物的现象表明，黏液-微生物组系统可能对这些植物的固氮过程至关重要，然而，宿主如何选择这些功能固氮菌并维持其在根际黏液微环境中的功能与稳态的机制仍不清晰，或需特殊的实验模型来加深对植物代谢物如何介导宿主-功能微生物组互作过程和稳态机制的理解。

3. 气生根黏液微生境中微生物组的稳态

宿主植物如何调控其微生物组成并维持益生菌-病原体的群落稳态，以最大化提升宿主适应性是植物-功能微生物组互作研究中的关键和热点话题。以往研究证明宿主因子和微生物共同维持微环境内微生物组稳态并介导宿主健康。然而，在宿主植物和微生物组维持微生物组稳态的调控因子及相关机制还知之甚少。同样，黏液微环境系统中因富含大量碳水化合物/碳源而如何避免环境微生物/病原菌“大爆发”？维持微生物功能与稳态也值得探索。研究者在此前发现气生根黏液中微生物多样性显著低于根际和土壤，而独特的黏液微生物组中含有更高丰度的固氮菌而非大量的病原菌和其他环境微生物（图2a）。此外，全球不同种植地点和生育期玉米黏液微生物组群落结构也相似，表明微生物组结构稳定和存在动态平衡现象同样存在于气生根黏液这一特殊微环境中（图2b）。

研究者此前关于双子叶植物的相关报道同样证明了黏液微环境中微生物组的动态平衡，且这一过程是由黏液内部微生物重要成员：保卫真菌（Gatekeepers fungus）所调控的，该菌可以产生抗菌物质特异性地抵御病原菌和环境微生物，却不抵御同域的固氮菌，该保卫微生物在宿主全植株“伴生”且在黏液微生境中与宿主建立有益的伙伴关系。同时，当筛选黏液中特殊高含量的代谢物时一些化合物同样具有抗菌功能（但依赖浓度效应）。以上发现对加深微生物组稳态、功能/保卫微生物成员提升宿主植物适应性的理解具有一定借鉴意义。因此，有必要深入解析特殊生态位中功能微生物组和其稳态的调控机制，尤其是在根际微环境和特殊的气生根黏液分泌物微生境中。

4. 根系分泌物-根际功能微生物组互作的新模型

根系特异性代谢物和微生物的互作被认为是宿主调控根际微生物组装的关键因子。理解根系分泌物塑造和调控植物微生物组的潜在机制对于促进植物生长和健康至关重要。基于在多点多物种均报道了这一典型且稳定的气生根黏液-功能微生物组的生物互作进展，研究者进一步提出将气生根黏液-益生菌系统作为一种研究根系分泌物-功能微生物互作的新模型。在这个实验模型中，研究者选择三种单子叶禾本科植物和一种双子叶藤本植物，检测其气生根黏液和地下根系分泌物和微生物组的异同。其中，功能微生物组包含能够在气生根黏液微生境中进行固氮或维持微生物群稳态的功能菌和保卫微生物（Gatekeepers microbes）。

该研究模型中研究者的科学假设和研究方法主要包含以下四个途径：

（1）确定黏液代谢物和微生物组的共性从而建立根系分泌物和功能微生物组之间的联系：分析不同气生根黏液植物的共有代谢物与核心微生物组。黏液微生境和地下根际根系分泌物和微生物组的差异也能为挖掘功能化合物成分提供线索（图3a）。

（2）验证根系分泌物和功能微生物组之间的互作关系，例如，关联代谢物和微生物组组分，一方面根系分泌物可以调控功能，而功能微生物也可以参与黏液化合物的代谢过程。

（3）确定黏液微生境中的功能组成，包括调控功能微生物组和微生物群稳态的关键代谢物和微生物（图3b）。

（4）植物-功能微生物组的微进化分析，从生态进化的视角解析多种植物中气生根黏液的形成和微生物互作过程（图4）。

最后，研究者提出可采用多组学方法（基因组、转录组、代谢组和微生物组）与分子生物学实验等分析、验证宿主黏液代谢物和微生物组的互作，并探究根际生态位中微生物稳态的调控机制。这个模型为特殊黏液分泌物与根际微生境中微生物功能和稳态维持机制提供了新的见解，有助于明细宿主对其微生物群落的功能的宿主调控因子与微生物稳态互作机制。

5. 关联根际生态位中的根系分泌物特殊组分与功能微生物组

确定根系分泌物中关键组分与调控功能微生物组的潜在机制对植物的健康和生长至关重要。本模型为确定根系分泌物调控功能微生物和抵御病原菌及环境微生物的关键化合物提供了新的见解。这些特殊的分泌物成分被定义为功能代谢物，例如，作为植物信号分子调控豆科植物与根瘤菌共生固氮过程的黄酮类化合物，这类物质还参与调控非豆科植物根系微生物组的组装过程。类似前沿性的研究表明：玉米根系通过释放黄酮类化合物招募特定的微生物，例如草酸杆菌科（Oxalobacteraceae），从而促进宿主在低氮条件下的根系发育和生长。该项研究揭示了黄酮类物质可能作为非豆科植物根系分泌物中的重要组分以招募相关的固氮菌（植物促生细菌PGPR，或固氮菌）。此外，水稻根系分泌物组分如芹菜素和类黄酮同样也可诱导固氮菌产生生物膜并促进其在根际固氮从而促进宿主生长。研究者此前的研究同样也发现双子叶气生根植物黏液中富集了黄酮类物质和碳水化合物。同时，气生根有无黏液的转录组数据表明：黄酮类物质生物合成和碳水化合物代谢的基因表达量在产生黏液的气生根中更高。因此，为了阐明宿主源代谢物和根际富集的功能微生物组这一重要的植物-功能微生物组互作过程和调控机制，我们提出以四种植物气生根黏液-益生菌系统作为分析功能代谢物和功能微生物组之间的关键互作研究的新模型。

在这个根系分泌物-功能微生物组互作模型中，一些功能代谢物被定义为“引诱剂”：是可以富集功能微生物组的根系分泌的化合物或营养物质。特异性的代谢物可以选择性地增加特定功能微生物组的丰度。研究人员此前的研究提供了一系列这类“调控因子”功能化合物列表，例如黄烷醇——表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、表儿茶素、柚皮素-7-O-新橙皮苷和柚皮苷，单宁——如没食子酸，氨基酸和衍生物——如L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、O-乙酰丝氨酸。上述功能化合物和黏液中的粘多糖可以重现最佳的根际环境，通过提供碳源和氮源，支持根系黏液微生境中功能微生物组的基础生长和定殖代谢，从而维持特定微生物如功能固氮菌的生长。因此，需要确定这些化合物是否可以促进功能微生物的繁殖、生物膜形成从而促进根际黏液微环境中微生物的稳定定殖。同时，这些化合物可以被功能微生物组进一步利用并被其他微生物再次代谢利用发生潜在的交叉喂养过程，可利用离体和接种等方法设计合成菌群以确定互作过程与机制。此外，前沿性的观点认为特定的黏多糖是参与宿主-功能微生物互作过程的重要调控因子，并从工程应用角度探索了其在农作物生产中的可持续利用方案。这些前瞻性的观点突出了关于植物-功能微生物组互作的分子机制的研究，表明了利用植物代谢物的能力在设计黏液功能固氮菌组合中的重要性。

根系黏液是富含碳水化合物的特殊代谢物，可为功能微生物组生长创造“天然培养基”和理想的生态位，但其对于病原菌和其他环境微生物同样具有“吸引力”。待解决的有趣和重要科学问题是：在这个特殊生态位-黏液微生境中如何保持微生物群的稳态使其利于功能微生物的定殖而抵御病原菌的入侵以最大化宿主植物的受益？前人研究表明，特殊的根系分泌物可以调控微生物群落结构和功能，同时也具有一定的抗菌活性以避免病原菌的入侵，例如在豆科植物-根瘤菌的共生系统中，类黄酮物质不仅可以招募根瘤菌，同时也可以抑制其他根际微生物的生长。因此，本模型提供了新的线索以鉴定“引诱化合物”（如益生菌和植物功能性微生物组互作的信号和营养物质）和“防御化合物”（如对病原体或环境微生物的抗生素活性物质）。研究人员前期工作也提供了一系列备选的具防御功能化合物，例如柚皮苷、硬脂酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、奎尼酸、熊果酸、胆碱、精胺、水杨酸、黄酮类、邻苯二甲酸酐。总的来说，黏液中可能包含一些诱导功能化合物和抗菌类的防御代谢物，本研究模型将有助于筛选和鉴定这些化合物类别及其功能（图3b）。

宿主植物分泌代谢物后被各类微生物的代谢并转化为其他化合物。因此，根系黏液代谢物的动态变化和微生物组间交叉喂养的潜在过程同样值得探索。黏液微环境与微生物胞外聚合物具有相似的理化性质，均为有利于养分移动且受保护的微环境中。此外，根系黏液可能在组成和功能上与哺乳动物肠道黏液类似，其含有黏蛋白、乳寡糖和其他多聚糖复合物。同时，黏液固氮菌例如固氮螺菌Azospirillum可通过水解酶将复杂的多糖分解为碳源以进一步为自身与互作菌株提供能量。该模型为碳源和其他代谢物调控黏液微生物群落和微生物互作提供见解，例如跨界互作和交叉喂养（图3c）。未来的研究可以利用黏液分解微生物和其他功能性微生物组之间的互作模型。

6. 微环境中微生物互作调控群落稳态

微生物群落成员间互作以维持微环境稳态是另一种潜在可能，功能微生物（如保卫微生物）可以抑制微环境内“不受欢迎”的病原微生物和环境微生物，但选择性地允许同域功能微生物生存。然而，较少研究关注根际微生物互作驱动微生物群落稳态的相关的过程和机制。此外，重要的话题是微生物的“稳态维持”和“生态失调”，尽管“微生物稳态”和宿主健康状况之间的因果关系仍然知之甚少。但在气生根黏液系统中，仅考虑黏液微环境如何维持微生物稳态可以相对简化试验，因为此时微生物组对宿主健康的影响可以适当忽略，毕竟根系黏液可以作为一个短期的物理屏障。

因此，本研究这一典型根系分泌物模型可以为同域微生物互作驱动功能微生物-病原菌动态平衡提供微生态视角。根系黏液微生境中碳水化合物的组成为深入探讨这一课题提供了理想的研究模型和具有“天然培养基”的物质基础。明确抵御病原菌及与同域固氮菌互作的保卫微生物（Gatekeepers microbes）对于理解根际微环境中微生物的稳态维持非常重要。同时，定殖抗性是微生物群落成员的集体属性，当单一菌株和其他菌株结合时才可能具有保护性。因此，了解黏液生态位中微生物的互作机制，并明晰这些微生物组是否介导了协同互作进而增强黏液利用或群落功能（如功能合作）、或者是否为拮抗互作（竞争，例如防御病原体）和其他跨界互作的过程和潜在机制是非常必要的。使用安娜卡列尼娜原则（AKP）中提出的微生物群落的β多样性等指标以确定黏液微生物组中微生物的功能状态、生态失衡和维持微生物稳态的核心组分。因此，可以从黏液中分离出益生菌、保卫微生物（Gatekeepers microbes）和环境微生物用于建立合成群落，以充分研究根际微环境中的微生物组稳态和同域生物互作。

此外，还需进一步研究宿主-特定化合物（根系分泌物）和功能微生物组的协同效应，从而阐明宿主代谢物和微生物互作维持根际微环境稳态的潜在贡献量。例如，根系黏液为根际细菌交流提供类似于胞外聚合物的生物膜环境以发挥功能。在此模型中关于黏液代谢物和利用微生物、功能微生物组以及其他环境微生物的互作值得进一步探讨。这些关系可能在植物-微生物组互作中非常普遍，而这些有趣的发现可能具有基础的生物学意义。

7. 植物气生根-黏液-微生物组的共进化及宿主对微生物组的级联调控

不同的动植物宿主之间调控其微生物组的机制是多样化的。进化生物学家一直关注植物器官和其他性状的发生和进化，以获得更多关于植物-微生物共生体适应环境的协同进化的信息。同样，植物学家和微生物学家也试图阐明根瘤菌共生体、丛枝菌根共生体和微生物组对植物的适应性进化的贡献。然而，植物和微生物进化过程中植物微生物组（包括驯化背景下的植物-微生物组微进化）的组装过程与机制并不清晰。与肠道微生物研究相比，很少有研究明确宿主植物基因-根系分泌物-功能微生物组间互作过程、级联效应及潜在机制，例如挖掘微生物组（调控）基因Microbiome gene（简称M基因）。而植物的气生根黏液作为一种典型的根系分泌物，具有与哺乳动物肠道黏液相似属性，是一种潜在的探索路径。

目前，关于植物遗传调控和性状进化对宿主-微生物组协同进化的动态影响知之甚少，且植物气生根黏液（或根系分泌物）和有益微生物的基因调控因子和机制在很大程度上是未知的。前沿研究发现了一个关键的ZmSBT3基因和UDP-糖基转移酶基因是玉米和高粱根系黏液分泌和固氮的负调控因子；其中后者也被报道参与拟南芥种皮黏液的分泌。在这些研究中，气生根-黏液被视为植物的特定性状因子，通过全基因组关联分析（GWAS）的方法鉴定潜在的遗传调控因子。但遗憾的是，这种根系黏液性状似乎会随着玉米的驯化而逐渐丢失，报道称只有一部分的现代玉米自交系（如HN5-724）保留了这一性状。因此，研究现代、农家品种和野生种的基因组多样性与表型性状，并鉴定其调节其他互作性状如微生物组互作的潜在过程是十分必要的。鉴定与植物-微生物互作相关的宿主遗传因素是植物-微生物互作研究是正在进行的主题，并且多个研究已经使用不同植物和全基因组关联分析来鉴定了潜在的关键宿主调节因子。鉴于此，研究者进一步提出将单子叶植物（禾本科植物Poaceae crops）和双子叶植物（野牡丹科Melastomataceae）的典型气生根黏液微生物组这一性状的发生和进化作为潜在进化生物学研究的模型。研究者提议将气生根-黏液-微生物组作为一种特殊的宿主发育性状，并将宿主基因组、基因表达、代谢物合成和运输以及其他多性状联合分析，以确定宿主基因型-功能基因-根分泌物（黏液）调控植物微生物组的潜在级联效应。

在这个植物-功能微生物组协同进化的模型中，根据气生根发育和黏液产生性状的差异而选择候选植物（图4a）。例如，选择具有不同气生根-黏液性状的高粱和玉米及其野生种，或现代不同品种和栽培种的禾本科作物作为单子叶植物的典型代表，以及3种具有相似性状的野牡丹科（Melastomataceae）藤蔓植物作为双子叶植物的研究材料。该模型中上述四种植物均在同一生境中表现出不同的气生根-黏液性状。

使用微生物组改善宿主生长和健康是一项挑战，因此本模型中还包括对微生物组调控M基因的筛选鉴定，以及明确宿主基因型-功能基因-根系分泌物（黏液）-植物微生物组的级联调控效应。目前大量的禾本科基因组、代谢组和遗传转化体系将为M基因及宿主-微生物组互作的机制提供见解。此外，微生物在较短宿主遗传世代内更替还意味着其可能在宿主的生育期内快速进化和遗传变异，表现出适应黏液环境这一宿主选择效应的微生物组特征，例如代谢黏液碳水化合物的能力和其他有利于宿主的性质，因此有必要进一步研究。

此外，小型的具有气生根的双子叶（野牡丹科）藤蔓植物可以进一步用于氮同位素标记试验和多组学测定，以确定气生根黏液性状形成的潜在分子和生理证据和黏液功能微生物组对宿主固氮的贡献量。研究者选择了三种近缘种植物的进而对其基因组、微生物组、转录组和代谢组进行测序和分析。这个模型将帮助我们理解植物气生根-黏液性状的发生和进化，并将其与宿主对微生物组的调控线索联系起来（例如M基因）。这一模型今后可扩展到更广泛种植的禾本科作物，从而增加其普遍性和应用潜力。

图4 多种植物气生根-黏液-微生物组性状发生相关的微进化模型，以明确宿主功能基因（转运蛋白）-特定代谢物-功能微生物组互作的级联效应

根系分泌物是宿主-微生物组互作的重要介质。然而，根系分泌物介导的宿主-功能微生物互作过程没有被系统深入研究。许多野生植物和禾本科植物（例如玉米和高粱）的气生根可以分泌大量的黏液，这种典型的根系分泌物/生物学现象却被明显忽视。此前的研究表明，富含碳水化合物和潜在抗生素的黏液为固氮菌提供了理想的生态位但却抵御病原体侵入。同时，黏液中似乎还存在保卫微生物以帮助宿主抵御病原菌和环境微生物的入侵。然而，宿主植物如何招募这些固氮菌和保卫微生物并维持微生境稳态仍不清楚。为了回答上述科学问题，我们基于气生根-黏液-微生物这一典型的根系分泌物-功能微生物组互作模式作为新的研究模型，为鉴定功能代谢物与微生物组之间的关键互作奠定理论与材料基础。

总的来说，这个特殊模型为植物在面临大量外界微生物时如何通过根系分泌物塑造与功能微生物的互作提供了新的见解。同样，关于气生根新的生物学功能和根际的传统定义范畴需要进一步讨论。最后，希望气生根黏液-功能微生物研究模型将为根际生物互作提供基础的生物学见解。