英文原题：Intracellular generation of alkyl radicals enabled by a self-catalytic ATRP nanoinitiator
作者：Yubin Chen，Yao Lu，Kai Hua，Junyan Li，Jingtao Zheng，Yanyan Pan，Yongzhong Du，Qiang Zhang*，and Weishuo Li*
背景介绍
通过人工化学手段来操纵细胞的功能或命运的方法在近些年来不断发展壮大。小分子化学反应（如点击化学、Staudinger ligation等），由于金属催化剂的使用会造成细胞毒性，且引入反应性基团涉及糖代谢等繁琐步骤。值得注意的是高分子聚合反应相对于小分子体系具有更优异的协同放大效应，且原位、在体生成的高分子聚合物能更好地模拟天然生物功能大分子在细胞内的行为（如折叠、组装等），实现与细胞内行为信号的动态耦合，进而可以更精准地调控细胞行为。但当前报道的人工高分子化学大多是在活细胞水平中进行的，而在体的人工高分子化学却很少被探索。这可能是由于反应所需的反应条件，如光或热引发，高单体浓度等在体内的实现仍然面临挑战。本课题我们受ATRP引发体系的启发，开发了一种自催化的ATRP纳米引发剂，用于在体生成烷基自由基，用于肿瘤治疗。具体来说在被过表达GSH的细胞内化后，ATPP纳米引发剂中的铜（II）被GSH还原为铜(I)，发生同时产生有毒的R·，从而选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。这一过程的发生在体外溶液水平、活细胞水平和小鼠动物水平中都成功得到验证。且该建立的反应可以成功诱导肿瘤细胞凋亡。我们的研究扩展了操纵细胞命运的高分子化学工具箱。
文章亮点
1. 研究团队创新地设计了一种自催化的ATRP纳米引发剂以在体内特异性触发ATRP引发过程产生有毒的R·。
2. 在无需任何外部刺激的条件下通过人工化学手段实现活体水平操纵细胞命运。
图文解读
我们首先通过可逆加成-破碎链转移(RAFT)聚合“接枝”生成自催化ATRP纳米引发剂Lac-P(iBBr)，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）、凝胶渗透色谱(GPC)、傅里叶红外光谱(FTIR)验证了Lac-P(iBBr)的成功合成（图1B-1D）。我们还观察到由于聚合作用，单体在Lac-P(iBBr)的质子谱中出现了典型的氢位移(图1E)。然后研究了Lac-P(iBBr)在水介质中的自组装行为。从图1F可以看出，LacP(iBBr)自组装成具有圆形形态的50 nm纳米颗粒。
图1. (A) Lac-P（iBBr）合成途径示意图；(B) 漆酶和Lac-P（iBBr）的聚丙烯凝胶电泳图；(C) 漆酶和Lac-P（iBBr）的凝胶渗透色谱图；(D) 漆酶、漆酶-链转移剂、Lac-P（iBBr）的傅里叶红外谱图；(E) 漆酶、漆酶-链转移剂、Lac-P（iBBr）的核磁共振氢谱图；(F) 漆酶和Lac-P（iBBr）的动态光散射实验及透射电子显微镜图。
为了证明Lac-P(iBBr)介导的R·生成策略在体外水平能够发生，我们用电子自旋共振(ESR)检测了生成的自由基。当GSH(浓度分别为1或10 mM，与肿瘤细胞相当)存在时，观察到自由基的信号(图2B)。接下来，我们研究了Lac-P(iBBr)介导的R·生成是否会发生在小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1，表达高水平GSH)中。在证明为此4T1细胞可以有效内化后， 我们在4T1细胞中检测产物的生成。从图2C可以看出，随着Lac-P(iBBr)浓度的增加，产生的自由基也越来越多。同时，细胞内GSH被Lac-P(iBBr)显著消耗，而Lac不被消耗(图2E)。此外，肿瘤中GSH的消耗也证明了Lac-P(iBBr)介导的体内ATRP启动过程(图2F)。
图2. (A) ATRP引发过程机理示意图；(B) 不同谷胱甘肽浓度下的Lac-P(iBBr)电子自旋共振结果；(C, D) 用LacP（iBBr）处理的4T1细胞中自由基的荧光图像和平均荧光强度统计；(E)用Lac-P（iBBr）处理的4T1细胞中GSH水平；(F)接受不同处理的小鼠肿瘤中的GSH含量。
接下来，我们研究了由Lac-P(iBBr)产生的R·是否可以攻击细胞内的生物大分子(如核酸、蛋白质、脂质)，从而诱导细胞凋亡。如图3A所示，当反应物浓度为70 μg/mL时，细胞存活率低于20%。与此形成鲜明对比的是，GSH水平较低的细胞对Lac-P(iBBr)不敏感。值得注意的是，即使在缺氧条件下，Lac-P(iBBr)的细胞类型选择性杀伤能力几乎保持不变。然后通过流式分析Lac-P(iBBr)诱导的细胞死亡。如图3C、D所示，Lac-P(iBBr)显著诱导细胞凋亡，在常氧条件下，近46.2%的细胞在接受Lac-P(iBBr)后发生凋亡。缺氧条件下细胞凋亡率为49.8%。活细胞染色进一步证明了Lac-P(iBBr)的抗肿瘤能力，结果与之前MTT的结果一致(图3E)。
图3. (A, B)在常氧和缺氧条件下，用Lac-P（iBBr）处理的4T1细胞（过表达GSH）和HUVEC细胞的活力；(C, D) 用PBS、漆酶、Lac-P(iBBr)处理后的4T1细胞的流式细胞检测分析；(E, F) 用Lac-P（iBBr）处理的4T1细胞的活细胞荧光图像和平均荧光强度统计。
总结/展望
综上所述，我们利用感兴趣细胞中的特异性和内源性信号作为开关，通过自催化ATRP纳米引发剂进行了细胞内烷基自由基生成策略。生成的毒性R·可有效杀死乏氧肿瘤细胞，抑制小鼠肿瘤生长。我们的研究扩大了攻克肿瘤缺氧的高分子化学工具箱。
通讯作者信息：
李伟硕 副教授
李伟硕：女，1990年09月生，副教授，江苏省双创计划“双创博士”（2021），江苏省优秀青年人才（2022），长期以来一直从事活细胞/活体高分子聚合反应方法学的开发，完成了高分子反应从试管到活细胞，再到活体动物的升级，为精细调控细胞行为提供新化学工具，并以此为平台探索其在蛋白质功能解析以及细胞治疗药物递送等领域的应用。基于上述研究，以第一作者/通讯作者（含共同第一/通讯作者）在Nat. Chem.、ACS Macro Lett、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Sci.、Adv. Sci、Nano Today、Biomaterials、J. Control. Release等杂志发表论文多篇。相关研究成果得到C&EN、Phys.Org、Chemistry World等媒体，及Nat. Rev. Chem.、Adv. Drug Deliv. Rev.、Acc. Chem. Res.等多个领域杂志的广泛肯定和报道。目前已获批十余项省部级项目，包括国家自然科学青年及面上基金、江苏省青年及优秀青年项目等。
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ACS Macro Lett. 2024, 13, XXX, 1233–1239
Publication Date: September 11, 2024
https://doi.org/10.1021/acsmacrolett.4c00306
© 2024 American Chemical Society
Editor-in-Chief
Stuart J. Rowan
University of Chicago
ACS Macro Letters 收录当代软物质科学各个领域的研究成果。在该科学中，大分子发挥了关键作用，包括纳米技术、自组装、超分子化学、生物材料、能量产生和存储以及可再生/可持续材料。
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