往期文章：
5. 关于转膜
问题描述：
1）明明赶气泡了，可显影发现还是有气泡？
2）条带为何不处于同一水平线，总是倾斜向上或向下？
3）辛辛苦苦转膜半天发现蛋白没转上去？
4）如何判断蛋白转膜没转到位或者转过了？
问题分析及解决方案：
1）气泡的产生并不只是在制作“三明治”的时候小心就可以避免的，在放置PVDF膜或NC膜时赶气泡确实是不可缺少的一步，除此之外还要注意在放置滤纸、海绵时也要格外小心，稍有不慎，轻微的位置挪动都有可能导致气泡出现；另外，对于湿转法而言，在注入转膜液时一定要从转膜槽的边角注入，切忌直接倒向“三明治”，液体的冲刷也会产生气泡哦；
2）在转膜时一定要固定好转膜夹，切勿挪动，否则本该在同一水平线上的条带却因操作失误而出现偏差。另外也要注意，海绵长期使用时弹性会下降，此时应该及时更换海绵或者多加一层滤纸进行固定；
3）转膜前要充分了解自己所做蛋白的分子量，最好做预实验探一下转膜条件，一般来说，分子量相对较大的蛋白转膜所需的时间会越长，电流也可以适当大一点。此外，特别要注意转膜液的电压，如若电压过低就要延长转膜时间或重新配制转膜液，转膜结束可以用丽春红染液判断蛋白是否成功转至膜上；
4）蛋白Marker是协助我们判断转膜的关键，倘若转膜结束，胶上还有蛋白Marker的残留就要警惕部分蛋白没有转至膜上；倘若膜的背面蛋白Marker的颜色要膜正面还要深，则证明转膜转过，有可能将部分蛋白转到了滤纸上；但若胶上没有任何Marker的残留，干干净净，且膜的正面蛋白Marker颜色深于背面，则证明转膜条件适宜。
6. 关于封闭、抗体孵育与洗膜
问题描述：
1）背景深如何降背景？
2）抗体可以重复使用吗？
3）有何注意事项？
问题分析及解决方案：
1）背景深可以通过提高封闭液的浓度、加大洗膜液的用量、增加洗膜次数、延长洗膜时间等加以改善，也需要注意蛋白提取时样本的前处理；
2）抗体可以重复使用，若条带开始变淡，即可选择重新配制抗体；
3）封闭、抗体孵育时速度不可过快，要给予其足够的结合时间，但洗膜时速度要快，加大洗膜力度，保证洗膜效果。
7. 关于显影
问题描述：
1)条带呈现波浪状；
2）条带部分弯曲；
3）条带“反白”，即中间空白；
4）条带拖尾；
5）条带出现黑斑；
6）无目的带或目的带特别淡；
7）条带连成一片，泳道之间没间隔等等。
问题分析及解决方案：
1）考虑电压电流不稳引起，多与电泳液配制有关，准确称量即可解决；
2）若中间条带弯曲，考虑胶未凝好或者胶中有不溶性颗粒等杂质的干扰，所以制胶时一定要选择干净的玻璃板，且要给予充分的凝胶时间；若最边缘的条带弯曲，则有可能是边缘效应引起，所以加样时最好采用中间的泳道；若条带呈现七扭八歪的状况，则多半是夹膜过紧过度挤压所致；
3）条带“反白”多由抗体浓度过高快速消耗底物所致，适当降低抗体浓度即可解决；
4）条带若出现明显的拖拽痕迹，甚至看起来像一条线拉下来一样，则多半是蛋白发生了降解；条带若出现类似火山喷发的情形，则多由抗体浓度过高导致；
5）大颗粒大小不均一的黑斑通常是脱脂牛奶等的不溶性杂质导致，而细小均一的黑斑则多由二抗引起，重新配制二抗即可解决；
6）无目的带或目的带非常淡可适当加大上样量，提高抗体浓度试试，如若一直未曾改善则考虑抗体特异性不高，需要重新换抗体；
7）泳道间无间隔多由上样量过大引起。
本文作者是"夏沫梦鸢"同学，在获得她的授权后实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：夏沫梦鸢
校对：煲仔饭
素材：Canva
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