MEM导言
铁死亡对C2C12成肌细胞的增殖活力、分化和新陈代谢的完整性产生不利影响，导致骨骼肌健康状况下降。这一过程背后的复杂机制尚不完全清楚。在本研究中，我们使用铁死亡诱导剂诱导了成肌细胞的铁死亡，并发现特定氧化还原代谢物（尤其是牛磺酸）明显减少。而补充牛磺酸能有效逆转铁死亡的有害影响，显著增加细胞谷胱甘肽，降低MDA和ROS水平，使受损的成肌细胞恢复增殖活力和成肌分化潜能。此外，牛磺酸还能下调HO-1的表达，降低细胞内Fe2+的水平，从而减少不稳定铁池。通过核磁共振代谢组学分析，我们观察到牛磺酸能显著促进对细胞膜修复至关重要的甘油磷脂代谢，并增强线粒体生物能代谢，从而增加肌肉卫星细胞再生所必需的能量储备。这些结果表明，牛磺酸是一种潜在的铁死亡抑制剂，可减轻这一过程的关键驱动因素，增强氧化防御能力，改善氧化还原平衡。这种综合效应可保护细胞免受铁死亡诱导的损伤。这项研究强调了牛磺酸作为一种有价值的铁死亡抑制剂的潜力，它能保护骨骼肌免受铁死亡诱导的损伤，并为恢复骨骼肌活力和促进骨骼肌再生的治疗策略提供了基础。
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01 铁死亡损伤成肌细胞可致代谢物水平发生显著改变
通过采用铁死亡诱导剂Erastin（ERA）和RSL-3分别诱导C2C12成肌细胞发生铁死亡。我们观察到，铁死亡诱导剂处理后，C2C12成肌细胞的数量和增殖活力显著降低（图1A-B）。为了确定与铁死亡相关的特定代谢变化，我们测定了对照组（CON）和伊拉司汀处理组（ERA）的代谢物水平。结果显示代谢物浓度发生了明显变化，如图1C所示。主要代谢物，包括牛磺酸、肌酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸、NAD+、肌醇、甘氨酸和苏氨酸，在暴露于ERA后都出现了显著下降（图1D）。
RSL通常被认为是GPX4活性的靶向抑制剂，但它也会对成肌细胞的代谢产生影响（图2A）。结果发现，只有8种代谢物的水平在RSL处理的成肌细胞中发生了显著变化，且大部分与ERA处理的成肌细胞不同（图2B）。
图1. 铁死亡诱导剂Erastin处理对成肌细胞增殖和代谢物水平的影响。(A) 用 Erastin（2 μM）处理的成肌细胞的代表性形态学图像。比例尺：200 μm。(B) 经 Erastin（2 μM）处理的成肌细胞的活力。 (C) 热图显示 CON 组（红条）和 ERA（2 μM）组（绿条）之间代谢物水平的变化。颜色条越红，代谢物水平越高；颜色条越蓝，代谢物水平越低。(D）直方图显示 CON 组和 ERA（2 μM）组之间代谢物水平的显著下降
图2. 铁死亡诱导剂RSL-3处理对成肌细胞代谢物水平的影响。(A) 热图显示 CON 组（红条）和 RSL-3 组（2 μM）（绿条）之间代谢物水平的变化。颜色条越红，代谢物水平越高；颜色条越蓝，代谢物水平越低。(B) 直方图显示 CON 组和 RSL-3 (2 μM) 组之间代谢物水平的显著下降。
02 牛磺酸改善铁死亡损伤的成肌细胞增殖与成肌分化潜能
我们将这些减少的代谢物补充到经ERA处理的成肌细胞中，并评估了它们恢复细胞活力的能力。结果表明，牛磺酸、肌醇、NAD+、谷胱甘肽和肌酸等代谢物能显著恢复ERA损伤的成肌细胞增殖能力（图3A）。考虑到GSH的缺乏是铁死亡发生的已知主要原因，并且Marcus Conrad曾指出调控铁死亡反应的三个主要途径包括CoQ10/FSP1途径，其中FSP1使用NADH/NAD+还原氧化的CoQ10，并通过将α-生育酚自由基（α-TOH-）还原为α-TOH，进而还原脂质自由基来对抗脂质过氧化。鉴于这些发现，我们没有进一步评估GSH和NAD+对减少铁死亡的影响。目前还没有相关报道表面牛磺酸、肌醇和肌酸是否能改善铁死亡。此前，本课题组已证明补充肌酸能显著增强C2C12成肌细胞的增殖，并深入探讨了肌酸在成肌细胞中的多效性。此外，我们还发现，补充牛磺酸可明显改善顺铂诱导的成肌细胞增殖活力下降以及成肌分化能力。因此，本研究旨在评估牛磺酸对铁死亡损伤的成肌细胞的影响，并阐明其潜在机制。
首先，再次评估了牛磺酸对铁死亡损伤的成肌细胞的最大有效浓度，并再次证实了牛磺酸在减轻ERA诱导的铁死亡损伤的功效（图3B-C）。结果显示，用5 mM牛磺酸处理后，2 μM ERA或2 μM RSL3处理的成肌细胞的存活率明显提高（图4A-B）。成肌细胞强大的成肌分化能力决定了其对骨骼肌再生和适应性至关重要，由此，我们研究了牛磺酸对ERA损伤的成肌细胞分化潜能的影响。与对照组相比，ERA组的肌纤维更少、更细，而ERA+TAU组的肌原纤维管更多、更粗（图4C-D）。肌原蛋白（MyoG）是肌管分化的早期标志物，标志着成肌细胞的成肌分化潜能。结果显示，补充牛磺酸可有效逆转ERA处理后MyoG表达的减少（图4E）。
图3. 牛磺酸补充可改善铁死亡诱导剂损伤的成肌细胞增殖能力（A） 不同代谢物补充对ERA处理的成肌细胞增殖影响，（B-C） 不同剂量牛磺酸对铁死亡诱导剂损伤后成肌细胞增殖活力的作用
图4. 牛磺酸改善铁死亡损伤的成肌细胞增殖与成肌分化潜能。(A-B）单用ERA（或RSL）或辅用TAU处理的成肌细胞的细胞活力。(C) 单独使用Erastin（ERA）或联合使用Erastin和牛磺酸（ERA+TAU）处理后，用结晶紫染色的肌细胞管形态。标尺：200 μm。(D）六个形态学视野中肌管的平均直径。(E）对照组（CON）、ERA 肌管（ERA）和ERA+TAU 肌管（ERA+TAU）中 MyoG 的表达。
03 牛磺酸减轻铁死亡导致的氧化应激和脂质过氧化物堆积
氧化应激和脂质过氧化物堆积是铁死亡的主要特征。我们使用荧光探针DCFH-DA来测定细胞的ROS水平。这种探针可以水解成DCFH，然后与细胞ROS反应，反映出自由基的总体水平。ERA处理会明显增加ERA成肌细胞中的ROS水平，而补充牛磺酸则会有效降低这些升高的ROS水平（图5A-D）。此外，我们还使用硫代巴比妥酸活性物质检测法测定了细胞中的MDA（一种稳定的脂质过氧化副产物）水平。与对照组相比，ERA 肌细胞的MDA水平升高，而补充牛磺酸可将异常的MDA水平逆转至对照组（图5E）。牛磺酸补充对ROS和MDA水平的影响也在被另一种铁死亡诱导剂RSL3破坏的成肌细胞中进行了研究。与之前的结果一致，补充牛磺酸能显著降低RSL3诱导的MDA升高（图6）。
因此，补充牛磺酸可有效减少受ERA和RSL3损伤的成肌细胞中ROS和MDA的积累，这表明牛磺酸具有减轻氧化应激和与铁死亡反应相关的脂质过氧化反应的潜力。
图5. 补充牛磺酸对ERA损伤的成肌细胞氧化应激和 MDA 的影响。(A-C) CON（A）、ERA（B）和ERA+TAU（C）组成肌细胞中 ROS 的典型荧光图像。比例尺：200 μm；(D) 三组摄影区域中荧光的相对强度。(E) 三组成肌细胞中 MDA 的细胞水平。
图6. 补充牛磺酸对 RSL3 损伤的成肌细胞中细胞 ROS 和 MDA 积累的影响。(A-C） CON 组（A）、RSL 组（B）和 RSL+TAU 组（C）成肌细胞中 ROS 的典型荧光图像。比例尺：200 μm； (D) 三个照相区域各组间荧光的相对强度。(E) 三组成肌细胞的细胞 MDA 水平。
04 牛磺酸提高了铁死亡损伤后成肌细胞的氧化防御能力
脂质过氧化物堆积通常是铁死亡导致氧化防御能力受损的结果。因此，我们研究了ERA和牛磺酸对GPx 酶活性及表达量的影响，GPx是将ROS转化为水或氧气的关键介质，同时将谷胱甘肽（GSH）转化为GSSG。GPx在减轻ROS和脂质过氧化物的毒性方面起着至关重要的作用，并维持膜磷脂的平衡并有助于抵抗铁死亡反应。我们的研究结果表明，GPX4的表达水平并没有受到ERA单独或与牛磺酸联合治疗的显著影响（图7A-B）。然而，牛磺酸的补充能显著增强GPx活性并提高谷胱甘肽水平（图7C-D）。对于 RSL3 损伤的成肌细胞，RSL3下调了GPX4的表达并抑制了GPx活性。牛磺酸对GPX4的表达仍然没有影响，但能提高GPx活性（图8A-D）。牛磺酸对GPx的调节加速了RSL损伤后成肌细胞对氧化产物的清除。这些结果表明，补充牛磺酸能有效提高GPx活性，促进脂质过氧化物的清除，从而加强铁死亡损伤的成肌细胞的氧化防御机制。
图7. 补充牛磺酸对ERA受损的成肌细胞中不稳定铁池和谷胱甘肽代谢的影响。(A) 三组HO-1和GPX4表达水平的免疫印迹分析。(B&E）A 组蛋白质表达的定量，（C）三组 GPx 活性的比较评估。(D）三组谷胱甘肽的相对浓度。(F）对照组（CON）、单独ERA处理组（ERA）和ERA与牛磺酸联合处理组（ERA+TAU）细胞内游离Fe2+的共聚焦成像。(G)三组摄影区域中 Fe2+ 的相对强度
图8. 补充牛磺酸对RSL3受损的成肌细胞中不稳定铁池和谷胱甘肽代谢的影响。(A) 三组HO-1和GPX4表达水平的免疫印迹分析。(B&E）A 组蛋白质表达的定量，（C）三组 GPx 活性的比较评估。(D）三组谷胱甘肽的相对浓度。(F）对照组（CON）、单独RSL3处理组（RSL）和RSL3与牛磺酸联合处理组（RSL+TAU）细胞内游离Fe2+的共聚焦成像。(G)三组摄影区域中 Fe2+ 的相对强度
05 牛磺酸通过调节TFR1减轻了铁死亡导致的亚铁离子堆积
铁代谢紊乱是铁死亡的一个公认触发因素。为了检测细胞内的Fe2+水平，我们使用了FerroOrange探针，这是一种创新的合成荧光探针，它能穿透活细胞并与游离的可溶性铁发生不可逆反应，从而导致荧光强度持续增加。通过激光共聚焦显微镜对这一反应进行成像，可准确显示细胞中游离的Fe2+。我们的研究结果表明，在受到ERA损伤的成肌细胞中，Fe2+ 出现了明显的积累，而牛磺酸的补充则显著减少了这种积累（图7F-G）。生物体内铁代谢的调节涉及Fe2+转运、储存和释放的复杂相互作用。血红素是肌红蛋白、血红蛋白和过氧化氢酶的重要组成部分，在血红素加氧酶 1（HO-1）的催化下，释放出结合的Fe2+，进而增加游离的Fe2+浓度。与细胞中Fe2+含量增加相一致的是，Erastin处理会上调HO-1的表达，这表明Fe2+的积累可能是HO-1分解血红素的结果（图7E）。重要的是，补充牛磺酸可显著降低HO-1的表达，这表明牛磺酸可通过下调 HO-1 的表达来减少Fe2+的积累。在RSL3损伤的成肌细胞中，我们也检测了补充牛磺酸对Fe2+积累和HO-1表达的影响。与之前的结果一致，补充牛磺酸不仅能显著缓解RSL损伤的成肌细胞中Fe2+的积累，还能显著逆转HO-1表达的升高（图8A, E-G）。
我们还测定了参与铁死亡（如Ptgs2、Gpx4、Nrf2、Ncoa4）和铁代谢（包括Tfr1、Hmox1、Mb、Cat、Fth1、Ftl1、Slc40a1和Slc39a14）的基因的mRNA表达。ERA处理可明显提高大多数与铁死亡反应和铁代谢相关基因的mRNA水平（图9）。具体来说，负责将转铁蛋白结合铁（TBI）转运到细胞中的转铁蛋白受体1（Tfr1）的表达被ERA下调，但被牛磺酸上调（图9C）。编码血红素加氧酶1（HO-1）的基因Hmox1与WB分析的结果一致，其mRNA水平受ERA影响显著升高，而受牛磺酸影响显著降低（图9D）。此外，含有血红素的Mb（肌红蛋白）和Cat（过氧化氢酶）的mRNA表达也受到牛磺酸的显著调控（图9E-F）。游离铁转运体Slc39a14的表达在ERA处理后明显增加，但牛磺酸略微降低了其水平（图9L）。因此，补充牛磺酸可促进非血红素铁（NHI）通过TFR1以TBI形式转运到细胞内，并促进铁结合蛋白的合成，从而有效降低铁死亡反应损伤的成肌细胞中游离Fe2+的水平，这表明牛磺酸具有调节细胞不稳定铁池（LIP）平衡的潜力。
图9. 补充牛磺酸对成肌细胞铁死亡和铁代谢相关基因 mRNA 表达的影响.
06 牛磺酸改变了ERA处理后成肌细胞的代谢轮廓
我们对成肌细胞水溶性代谢物进行了一维 1H-NMR波谱检测，获得了各组成肌细胞的亲水代谢物的一维 1H-NMR 光谱，并鉴定出30种代谢物（图10）。
图10. 布鲁克 Avance III HD 850 MHz NMR 波谱仪采集的三组成肌细胞的水溶性代谢物的代表性 1D 1H-NMR 图谱。谱图中标注了代谢物的归属情况。 C: 空白组, E: ERA处理组, ET: 牛磺酸治疗组
我们使用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的多元统计分析方法来对预处理后的数据矩阵进行分析，以区分不同处理条件下代谢谱的轮廓变化。PCA得分图显示，对照组（C）、经ERA处理的成肌细胞（E）以及经ERA和牛磺酸联合处理的成肌细胞（ET）之间存在明显的差异（图11A-C），而PLS-DA则锐化了各组之间的差异（图11D-F）。为了确保PLS-DA模型的可靠性，我们对已建立的PLS-DA模型的参数进行了200次置换，确保这些模型不存在过拟合，这证明这些模型具有很好的解释和预测能力（图11G-I）。我们的研究结果表明，与对照组相比，ERA处理能显著改变成肌细胞的代谢谱，而补充牛磺酸能显著改变单用ERA处理的成肌细胞的代谢谱，这表明牛磺酸对ERA诱导的代谢变化具有调节作用的。
图11. 对单独或与牛磺酸联合使用ERA治疗的成肌细胞的核磁共振数据集进行多变量统计分析。(A-C）C、E 和 ET 组（A）、E 和 C 组（B）以及 ET 和 E 组（C）的 PCA 模型得分图；（D-F）C、E 和 ET 组（D）、E 和 C 组（E）以及 ET 和 E 组（F）的 PLS-DA 模型得分图； (G-I) 对 C 组、E 组和 ET 组（G）、E 组和 C 组（H）以及 ET 组和 E 组（I）进行200次置换检验验证 PLS-DA 模型的鲁棒性。
07 重要性及特征性代谢物的筛选和确认
投影变量重要性（Variable Importance in Projection，VIP）是衡量变量和多元统计模型之间协方差和相关性的重要参数，用于评估代谢物对群体分类的影响。我们筛选了能突显组间代谢差异的重要代谢物（VIP＞1）。对E组与C组进行统计分析后发现了8个重要代谢物：葡萄糖、甘氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、亮氨酸、肌醇、谷氨酸和乳酸盐（图12A）。相反，与E组相比，ET组有9种显著的代谢物：葡萄糖、天门冬氨酸、亮氨酸、肌醇、丙氨酸、甘油磷酸胆碱、磷酸肌酸、β-丙氨酸和谷氨酰胺（图12B）。符合VIP > 1 和 FDR q < 0.05 标准的代谢物被认为是特征代谢物。因此，我们从 E 与 C 的比较中确定了7 个特征代谢物（甘氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸、乳酸、葡萄糖、肌醇和亮氨酸）。从 ET 与E 的比较中确定了六种特征代谢物（丙氨酸、磷酸肌酸、谷氨酰胺、葡萄糖、肌醇和亮氨酸）。葡萄糖、肌醇和亮氨酸是两种比较中明显的共同特征代谢物（图12C），表明它们在对Erastin 的代谢反应和牛磺酸调节中的潜在意义。
代谢物的紊乱会导致代谢途径的改变，从而引起病理生理变化。为了确定单独使用ERA与对照组相比，以及与牛磺酸联合使用与单独使用ERA相比，成肌细胞的哪些通路发生了明显改变，我们使用 MetaboAnalyst 5.0 根据所有识别的代谢物的浓度进行了全面的通路分析。在这两项比较分析中，有十条途径发生了显著变化： 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢，牛磺酸和次牛磺酸的代谢，谷胱甘肽的代谢，苯丙氨酸的代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，精氨酸和脯氨酸的代谢，组氨酸的代谢，烟酸和烟酰胺的代谢。这些结果表明，补充牛磺酸可以通过靶向受损的代谢途径，有效调节ERA受损的成肌细胞的代谢改变（图12D-E，表1）。
为了直观地表示单独使用ERA或ERA+TAU处理的成肌细胞中发生明显改变的途径，我们绘制了一张示意图（图 13）。ERA造成了不稳定铁池、氧化还原稳态、甘油磷脂代谢、糖生成和线粒体生物能的紊乱，这导致成肌细胞的再生和成肌潜能降低。相反，补充牛磺酸可减少脂质过氧化物、ROS、游离Fe2+的积累，增强氧化防御能力，调节甘油磷脂代谢和线粒体生物能。这些因素共同作用，促进了细胞膜的修复和能量的产生，证明了牛磺酸在改善铁死亡方面的多种作用。
图12. 两两比较分析确定的重要代谢物、特征代谢物和明显改变的代谢途径。E 组和 C 组之间（A）以及 ET 组和 E 组之间（B）按 VIP 值排列的重要代谢物。(C) 在 E 组与 C 组之间以及 ET 组与 E 组之间的比较中发现的特征代谢物。E 组和 C 组之间（D）以及 ET 组和 E 组之间（E）的代谢途径发生了明显变化。
表1 显著改变重要性通路的确认
图13. ERA组与CON组、ERA+TAU组与ERA组之间两两比较确认的明显改变的代谢途径示意图
MEM结语
骨骼肌的适应能力和再生能力对于应对生理需求和从重大损伤中恢复至关重要。多项研究表明，老龄小鼠或大鼠的骨骼肌中存在铁蓄积。并且，谢黎炜研究员及其团队在老龄小鼠的骨骼肌中观察到了铁积累和TFR1缺失。这项研究表明，老年小鼠体内TFR1的缺失会增加非转铁蛋白结合铁的转运比例，导致铁死亡，最终损害骨骼肌的再生能力。在我们的研究中，我们用ERA诱导C2C12成肌细胞的铁死亡，并发现牛磺酸是与铁死亡过程密切相关的重要代谢物。而牛磺酸的补充被发现是一种有效的对策，可以抵御铁死亡对成肌细胞的有害影响，如脂质过氧化物堆积、ROS 和游离Fe2+，从而减少不稳定铁池，改善细胞内氧化还原稳态的平衡。此外，牛磺酸还能增强肌细胞的氧化防御能力，促进细胞膜修复所需的甘油磷脂代谢，增强线粒体生物能，从而增加肌肉卫星细胞再生所需的能量储备。
鉴于牛磺酸水平的增加对铁死亡损伤成肌细胞的保护作用，我们将致力于进一步研究牛磺酸对铁死亡相关骨骼肌损伤的影响，并在动物模型中阐明其潜在机制。这项研究加深了我们对与铁死亡相关的代谢动态的认识，并为铁死亡相关骨骼肌损伤的肌肉修复和再生的策略提供了初步依据。
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声明：本资料中涉及的信息源于标注的论文，不代表MEM的观点。推文仅供参考，原文内容请点击“阅读原文”阅读。、
审阅：林东海 教授（厦门大学）
编辑：刘楚琛 科研助理（南宁师范大学）
审校：刘 西（厦门大学）
