尼龙12是一种重要的工程塑料，具有吸水性低、相对密度小、耐磨性高以及阻燃等优异性能，在3D打印、汽车制造、油气开采、医疗器械等诸多领域都有广泛应用。传统的尼龙12化学合成方法步骤繁杂，还需用到有毒且具腐蚀性的原料，导致技术门槛高、环境影响大等问题。目前，虽然已有从植物油提取的十二烷酸(DDA)及其酯生物转化制备尼龙12单体ω-AmDDA的报道，但该方法可能加剧森林砍伐和生物多样性丧失。因此，开发从葡萄糖生产ω-AmDDA的生物合成路径具有重要意义。
为此，研究团队通过工程化改造大肠杆菌，引入特异性催化C12酰基-ACP水解的硫酯酶和由P450酶、醇脱氢酶和转氨酶组成的多酶级联反应，实现了从葡萄糖到ω-AmDDA的直接生物合成。构建的初代细胞工厂的ω-AmDDA产量为3.3 mg/L，首次证明了这一从头生物合成路径的可行性。进一步通过模块化途径工程、氧化还原和能量平衡的重建、氧化应激耐受性的强化、限速酶P450的重设计和二聚体增强等多层次调控策略，实现了在摇瓶中从葡萄糖到ω-AmDDA的471.5 mg/L产量。这项工作为尼龙12的可持续生产提供了新途径。
前期工作基础
在前期工作中，研究团队通过在大肠杆菌中构建由P450酶、醇脱氢酶和转氨酶组成的多酶级联反应，并在此基础上通过关联中心代谢途径和外源人工途径构建多个辅因子再生循环，实现了DDA到ω-AmDDA的高效生物转化，产率达到96.5% (Metab Eng 2020, 62:172; ZL201910749344.5)。
从DDA到ω-AmDDA的生物转化
研究关键突破
1. ω-AmDDA从头生物合成途径
的构建和模块化途径工程
研究团队通过构建大肠杆菌“细胞工厂”，将葡萄糖直接转化为尼龙12单体。他们在大肠杆菌中引入了一种特异性催化C12酰基-ACP水解的硫酯酶（BTE），以葡萄糖为原料实现DDA的选择性合成，并结合由P450酶、醇脱氢酶和转氨酶组成的多酶级联反应系统，将DDA进一步转化为目标产物ω-AmDDA。为了提高产量，研究团队采用模块化途径工程策略，将复杂的合成途径分为四个模块：糖酵解、乙酰辅酶A激活、脂肪酸合成和DDA转化。通过优化模块间的平衡表达以及调整培养条件，将ω-AmDDA产量由3.3 mg/L提升至242.8 mg/L。
ω-AmDDA从头生物合成途径
的模块化调控
2. 辅因子工程和耐受性工程重构
能量平衡&增强氧化应激防御
在生物合成过程中，细胞需要大量能量和辅因子来支持复杂反应的进行。研究团队通过引入高效葡萄糖转运蛋白（Glf），促进未磷酸化葡萄糖的摄取，用作葡萄糖脱氢酶（GDH1）的底物，并过表达转氢酶（PntAB），增强还原力NADPH的供应与再生。此外，通过敲除竞争性消耗ATP的基因（柠檬酸铁转运ATPase基因fecE），有效减少了能量浪费，使产量进一步提升。同时，为增强细胞对氧化应激的耐受性，团队过表达了氧化应激调控因子OxyR，显著降低了胞内活性氧水平。这一改造不仅改善了细胞生长情况，还使ω-AmDDA产量达到370.9 mg/L。
ω-AmDDA细胞工厂的辅因子工程
和耐受性工程
3. 限速酶的蛋白质工程改造和自
组装调控
在ω-AmDDA生物合成途径中，催化DDA羟基化反应的P450酶是一个重要的限速酶。研究团队利用蛋白质工程手段对P450酶进行理性设计与定点饱和突变，通过原位高通量筛选和组合突变获得活性提高89%的突变体CYP153Am4-NCP；并进一步在P450酶N端融合二聚化增强结构，使其催化效率再提升了44%。
P450酶的分子改造
最终，经过酶、途径、细胞多个层次的综合代谢调控，获得的工程菌株在摇瓶发酵18小时后ω-AmDDA产量达到471.5 mg/L，比初始菌株（3.3 mg/L）提高了140余倍。该研究首次实现了从葡萄糖到尼龙12单体ω-AmDDA的高效从头生物合成，为尼龙12的可持续生产奠定了基础。同时，研究中建立的多层次调控策略为其他复杂代谢途径产物特别是脂肪酸衍生物的生物合成，提供了有益的借鉴。
从头合成ω-AmDDA的
细胞工厂构建与调控
论文的第一作者是浙江大学化学工程与生物工程学院博士研究生葛佳炜和王婷，通讯作者为浙江大学化学工程与生物工程学院叶丽丹副教授。研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和中央高校基本科研业务费专项资金等项目资助。
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