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一、非理性设计改造酶主要是通过定向进化的方法，在不依赖酶结构和作用机制详细知识的情况下对酶进行改造，以下是主要方式：1、易错 PCR
原理：在正常的聚合酶链式反应（PCR）过程中，通过改变反应条件来增加 DNA 聚合酶在复制 DNA 时引入错误（突变）的概率。比如增加镁离子浓度、改变 dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）的比例、添加锰离子等，使扩增得到的基因带有随机突变。这些突变基因编码的酶就可能产生新的特性。操作及应用示例：在进行易错 PCR 时，先设计合适的引物，然后将含有目标酶基因的模板 DNA、引物、DNA 聚合酶、dNTP 等成分混合，在调整后的反应条件下进行 PCR 扩增。例如，在改造某种脂肪酶用于洗涤剂工业时，利用易错 PCR 产生大量突变体，然后在含有油脂和洗涤剂成分的筛选体系中，挑选出活性更高、稳定性更好的脂肪酶突变体，使其能在洗涤剂的复杂环境和较高温度下更有效地分解油脂污渍。2、DNA 改组
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图源：网站
原理：将一组有一定同源性的 DNA 序列（可以是来自不同物种的同源基因，也可以是同一物种的不同突变体基因）用核酸酶切割成小片段，这些小片段在没有模板的情况下通过自身的互补序列重新随机拼接，组合成新的 DNA 序列。新的 DNA 序列所编码的酶就有可能融合了不同亲本酶的优良特性，或者产生全新的功能特性。
操作及应用示例：首先获取一组相关的 DNA 序列，用核酸酶（如 DNase I）将它们切割成小片段，然后通过 DNA 连接酶或自身退火等方式让这些片段重新组合。例如，对于几种能降解不同类型有机污染物的酶基因进行 DNA 改组，将改组后的基因文库导入微生物宿主中，筛选出能够同时高效降解多种有机污染物的新型酶，用于环境治理中的生物修复。
3、交错延伸过程
原理：这是一种在体外模拟基因重组的方法。在 PCR 反应体系中，将多个模板 DNA 混合，在引物延伸阶段，新合成的 DNA 链可以在不同的模板之间转换，从而产生重组的 DNA 序列。它可以快速地产生大量具有不同序列组合的 DNA，增加酶的多样性。
操作及应用示例：在反应体系中加入多个目标酶的基因模板和引物，通过控制 PCR 循环参数，使引物延伸过程能够在不同模板间交替进行。比如在改造具有多种底物特异性的酶时，利用交错延伸过程产生重组基因，然后筛选出对新底物组合具有更高活性的酶，用于生物合成过程中多种底物的同时转化。
图源：王 千，等：合成生物学酶改造设计技术的研究进展
二、非理性设计改造酶的方法主要指的是酶的定向进化技术，其具有以下优势：
无需详细结构信息：与理性设计需事先了解酶的空间结构和催化机制不同，非理性设计不需要对酶的氨基酸序列、三维结构以及催化机制等有深入、准确的认知，即可开展实验设计。这大大降低了对酶学基础研究的要求，拓宽了可改造酶的范围，使更多未知结构和复杂机制的酶能够成为改造的对象，为新型酶的开发提供了更多可能性。
更接近自然进化：模拟自然进化机制，如随机突变、基因重组和自然选择等过程，能在短时间内创造出大量的突变体文库，有效增加酶的多样性。这种多样性使得酶在进化过程中更有可能产生新的特性和功能，从而更好地适应各种不同的应用需求，如在不同的温度、pH 值、底物特异性等条件下发挥作用。
快速获得有益突变：通过定向选择，可以快速筛选出具有所需性质优化的突变体酶，大大缩短了从天然酶到具有特定性能酶的研发周期。相较于自然进化需要漫长的时间来积累有益突变，定向进化可在数年、数月甚至数天内完成，显著提高了酶改造的效率，能够更快地满足工业生产、医药研发等领域对高性能酶的迫切需求。
可操作性强、成本较低：实验操作相对简便，主要基于常见的分子生物学技术，如 PCR、基因克隆等，不需要复杂的仪器设备和高昂的试剂成本。同时，由于不需要事先进行大量的结构解析和理论计算等工作，也减少了人力、物力和时间的投入，具有较高的性价比，适合大规模的酶改造研究和应用。
能实现多特性同时优化：可以使酶的多个特性同时得到优化和改善。例如，不仅能够提高酶的催化活性，还可以增强酶的稳定性、改变酶的底物特异性或对映体选择性等，从而获得综合性能更优的酶，更好地满足实际应用中对酶的复杂要求。
三、以下是一些非理性设计改造酶的成功案例：
β- 半乳糖苷酶的改造：通过易错 PCR 和连续易错 PCR 对保加利亚乳杆菌 L3 的 β- 半乳糖苷酶基因进行随机突变，筛选得到了受体选择性拓宽的突变酶。如突变酶 W980F 对对苯二酚的转糖基产物产量明显提高，且对酚羟基受体的转糖基能力较原始酶显著增强，还获得了能对白藜芦醇进行糖基化的突变酶 252，其 6 个氨基酸位点发生突变，分别为 Q40R、K85R、F117S、D433G、V511A、E707G，进一步研究发现 117、511、707 位的单点突变也能使该酶获得对白藜芦醇的转苷能力。枯草杆菌蛋白酶 E 的改造：利用易错 PCR 技术，改变 PCR 反应条件，使 Taq DNA 聚合酶引入随机突变，经过多轮扩增累积突变。经第一次定向进化后得到的突变体 PC3 在 60% 和 85% 的二甲基甲酰胺（DMF）中的催化效率 kcat/Km 分别为天然酶的 256 倍和 131 倍，比活性提高 157 倍。再经两次定向进化后的突变体催化效率比 PC3 高 3 倍（60% DMF），比天然酶高 471 倍。头孢菌素酶的改造：采用 DNA 改组技术，将来自 4 个不同菌种的头孢菌素酶基因视为一个基因库，对其进行切割和重组。单独进化的 4 个基因中每个酶基因对拉氧头孢抗生素的抗性均提高了 8 倍左右，而 4 个基因在一个体系中同时参与改组后，抗性提高了 270 倍 - 540 倍，进化速率提高了约 50 倍，最佳突变体含有 4 个基因中 3 个基因的 8 个基因片段，33 个突变位点。D - 泛解酸内酯水解酶的改造：以来源于拟轮生镰孢菌的内酯水解酶为对象，通过易错 PCR 和饱和突变相结合的非理性进化方法，获得了包含1-14个氨基酸位点的单突变或组合突变体，水解活性相对于亲本酶提升了2.3-128 倍。皱褶假丝酵母脂肪酶的改造：利用 DNA 家族改组技术对皱褶假丝酵母脂肪酶 6 条同工酶基因进行定向进化，构建嵌合酶基因文库，并结合全基因密码子改良、基因剂量效应调整、分子伴侣共表达及过程控制等多策略，实现了该脂肪酶的异源高效表达，重组子在 10L 发酵罐中的高密度发酵最高酶活力超过 20,000U/mL。此外，还采用定点突变的方式改进了皱褶假丝酵母脂肪酶的热稳定性，获得 Tm 值最大提高了 9.40℃的突变重组子。腈水解酶的改造：发明了一种针对酶活性口袋的半理性设计定向进化策略 alf - 扫描，应用于腈水解酶底物偏好性改造。通过丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸对活性口袋残基进行扫描突变，再结合定点饱和突变以及组合突变技术，获得了具有芳香腈底物偏好性以及催化效率提升的腈水解酶突变体 V198L/W170G，与野生型相比，其对 4 种芳香腈底物的比酶活分别提高了 11.10、12.10、26.25 和 2.55 倍。细胞色素 P450 的改造：从假单孢菌细胞色素 P450 的定向进化得到的突变体，在无辅助因子存在下，通过 “过氧化物途径” 方法可羟基化萘，比天然酶的活性提高 20 倍。有什么想法欢迎评论区留言讨论！
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