生物成像技术是生命科学研究的重要工具，尤其是激光扫描共聚焦显微技术，凭借高空间分辨率和光学切片能力，在脑科学、肿瘤研究和活体细胞监测等领域得到了广泛应用。然而，传统激光扫描共聚焦显微系统大多使用可见光（380-760 nm），因生物组织对短波长光的强散射作用，难以实现深层成像。相比之下，近红外二区（NIR-II，900-1880 nm）波段的光具有散射低、自发荧光弱和适度吸收的显著优势，为活体深层组织的高分辨率成像提供了可能性。
尽管NIR-II共聚焦显微技术在深层成像上展现了巨大潜力，但传统系统通常依赖于针孔的精确调节，且因激发光与荧光均位于不可见波段，操作复杂、成本高，阻碍了其在非专业领域的推广。因此，亟需一种更为简洁、稳定且易于使用的成像系统，以推动技术的普及。
浙江大学钱骏团队与武汉理工大学张明曦团队合作，创新性地将光纤波分复用（WDM）技术引入NIR-II共聚焦显微系统，显著简化了传统系统的设计和操作。研究团队利用WDM技术，将传统显微系统中的二色镜、滤光片和针孔等多个组件整合至单一的光纤结构中，实现了激发光与荧光的精确分离。这样不仅减少了系统组件数量，还显著提高了系统的稳定性和操作便捷性。
图1 简化NIR-II共聚焦系统整体配置a. 基于WDM技术的简化NIR-II荧光共聚焦显微系统示意图。b. WDM光纤端口示意图及分光原理。c. 反射式准直器及光纤纤芯替代针孔的原理。d. WDM光纤1550 nm 端口的插入损耗。e. SNSPD在不同波长下的量子效率。
图2 小鼠脑血管共聚焦显微成像。a1-a10. 不同深度的脑血管 NIR-II共聚焦显微镜图像。a8,a10.中曲线为血管沿黄线的横截面荧光强度分布图。数字表示SBR。b. a4中血管沿绿线的横截面荧光强度分布图。c. a9中血管沿绿线的横截面荧光强度分布图。d. 小鼠脑血管的三维重建。
结论：
团队从光通信领域借鉴了成熟的WDM技术，并成功将其引入NIR-II生物成像领域，开辟了深层组织成像的新路径。相比传统NIR-II显微系统，该方法利用WDM光纤替代了二色镜、滤光片和针孔，将激发光和荧光针孔合并，使得系统整体集成度更高、调节难度下降，能够在低激发功率下实现高对比度的1000 μm小鼠脑血管成像和300 μm小鼠肝脏血管成像。在成像深度、分辨率及操作便捷性方面均有显著优势，系统的光学设计更加精简，避免了传统显微镜中对多个独立光学元件的复杂调节。所有组件均通过光纤连接，大幅减少了机械误差对成像稳定性的影响，为非专家用户快速上手提供了可能。
论文信息：
From Optical Fiber Communications to Bioimaging: Wavelength Division Multiplexing Technology for Simplified in vivo Large-depth NIR-IIb Fluorescence Confocal Microscopy
Xuanjie Mou, Tianxiang Wu, Yunlong Zhao, Mubin He, Yalun Wang, Mingxi Zhang*, Jun Qian*
Small Methods
DOI: 10.1002/smtd.202401426
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