关于体内（动物）实验中X基因的下调、过表达的干预手段，你一般会选用什么实验方法呢？
这个是国自然研究内容、方案中需要仔细斟酌的一环。
来看看被毙的标书评审意见中，专家是怎么说的吧。
案例1：尾静脉注射，如何保证特异性作用？
案例2：尾静脉注射干预某基因的表达，如何保证特异性？
案例3：尾静脉注射无法保证特异性敲减某基因，可用基因小鼠
“研究方案中使用shRNA腺病毒（AAV）对目标基因进行敲减，靶向性和效率都存在问题，建议使用基因鼠来设计研究方案”。
那么我们需要讨论两个问题：
腺病毒动物实验中，是否有其他方式比尾部静脉注射要更加特异性呢？缺点是什么？
CRISPR基因动物是否可以全面代替shRNA的沉默手段呢？
（一）用于基因治疗的AAV是什么？
目前大多数基因治疗应用的仍是病毒载体，这些病毒载体经过改造后不具有致病性。广泛应用的病毒载体包括腺病毒载体（ADV）、慢病毒载体（LV）、单纯疱疹病毒载体（HSV）、痘病毒载体（PV）及腺相关病毒载体（AAV）。
AAV载体携带shRNA或者过表达基因，特异性地干预靶细胞中的X基因
腺相关病毒载体（AAV）具有宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达稳定和物理性质稳定等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中, 并已成为世界上最常用的基因治疗载体之一。
而本身AAV入侵动物细胞不具有特异性效果，那么其注射方式会影响其特异性吗？
来自于www.chictr.org.cn（中国临床试验注册中心）
再来看看美国clinicaltrials.gov上的数据，截止2022年6月，全球已经进行了200多项利用AAV递送蛋白质基因的研究，70余项临床试验仍在进行中，如表中所示，占据前三的是血液疾病、神经系统疾病和视网膜病变，分别占比17.3%，13%和11.1%。
▲ AAV临床试验现状（星耀研究院制图）
（二）系统注射和局部注射，孰好孰劣？
而机体的AAV系统性注射中最常见的注射方法有尾静脉注射、腹腔注射等。 局部注射主要包括视网膜下腔注射、脑立体定位注射、玻璃体腔注射、肠系膜上动脉注射、脾脏注射、灌胃、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射、脊神经内注射等。
我们以心脏疾病的国自然研究方案为例，AAV在心脏的注射方式有多种：心肌原点注射、冠状动脉注射、颈静脉注射和尾静脉注射均可以将药物递送到心脏，通常文献报道较多的是心肌原点注射和尾静脉注射（观看视频）。
如果是动物实验的话，推荐使用特异性更强的组织直接注射，虽然创伤更大，但特异性强。
（三）ShRNA相比CRISPR、Cre\Loxp等沉默方式，熟好熟劣？
ShRNA腺病毒转染，只是沉默，同时相比较CRISPR等技术，具有脱靶效应，而其他优缺点相比较如下：
来自于源井生物
最后，总结如下：
虽然尾部静脉注射对机体伤害最小，但尾部静脉注射尽量更换为组织特异性地注射（局部注射），要么就构建CRISPR基因敲除的小鼠直接代替“每批小鼠”的尾部静脉注射。
RNAi（siRNA、shRNA）的效果不如CRISPR，CRISPR技术超越RNAi已是大势所趋，因此国自然项目中可以广泛使用CRISPR技术干预目的基因的表达。最主要的是，价格并没有那么贵了，小几万能够搞定基因鼠，但就是繁育周期较长（1.5年左右）
2024年度国自然医学部50大科研热点中标数统计如下：
本团队从国自然、省市级课题申报、学术代表作规划、实验方案设计、科研技能教育培训等提升年轻科研者科研水平，真正掌握国自然课题设计的核心要点、精妙逻辑和标书撰写技巧，提高标书水平和质量，最终中标国自然。
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