Cell Metabolism | 靶向肠道微生物氮循环和细胞摄取铵改善多发性骨髓瘤硼替佐米耐药性

多发性骨髓瘤是一种由恶性浆细胞分泌过多单克隆免疫球蛋白引起的疾病。目前的治疗方法包括蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物和单克隆抗体等，但由于药物抗性和容易复发，MM仍然被认为是不可治愈的。

有研究报道肠道菌群在MM的治疗中起重要作用，但是肠道中的氮循环菌株在MM患者中的富集与疾病复发之间的关系尚不清晰。

肠道菌群种类在MM患者和健康对照组之间表现出不同的丰度

研究者收集了若干名健康对照（HC）、患者（AD）和复发患者（RMs）的粪便，用于宏基因组测序和生物信息学分析。对收集的信息进行了主坐标分析（PCoA），发现各组在属，种丰度水平上有所不同。最后从复发患者中收集到了丰度逐渐增加的13种肠道菌株。

C. freundii与MM复发相关并诱导BTZ耐药

将RMs中富集的13种菌株单独进行受试者工作特征（ROC）分析，鉴定出具有更大的曲线下面积（AUC）的3种细菌——C. freundii、K. oxytoca和R. ornithinolytica，其中只有C. freundii与AD复发时间呈负相关，且C. freundii患者的平均治疗线数明显更高。这些发现表明，C. freundii的丰度可能与MM复发的可能性有关。之后研究者进行了粪菌移植（FMT）实验以及单菌定植（SBC）实验，确证了C. freundii导致MM细胞对BTZ耐药。

C. freundii诱导MM中NH₄⁺的积累

研究者在C. freundii定植实验中测定了小鼠盲肠内容物和血清中NH₄⁺的浓度，发现CFr定植的小鼠铵的浓度升高。R. ornithinolytica的丰度与盲肠和血清NH₄⁺浓度呈强正相关，而K. oxytoca则缺乏这种相关性。研究者检测了分别移植了AD和RM患者粪便菌群的小鼠中的NH₄⁺浓度，还评估了来自RMs的样本中C. freundii的丰度与粪便和血清NH₄⁺浓度之间的关系，发现两者之间均呈正相关。这些结果表明C. freundii介导了MM患者体内NH₄⁺的积累。

NH₄⁺加速MM进展并诱导复发

为了验证MM患者体内NH₄⁺的积累是否在MM的进展或复发中起功能作用，研究者评估NH₄⁺与MM临床特征的相关性，发现高NH₄⁺的RM表现更严重病情。研究者用NH₄⁺浓度更高的培养基培养ARP1和H929细胞，接下来在该培养基中添加BTZ、阿霉素（ADM）、来那度胺（Len），观察到NH₄⁺能促进细胞增殖，降低细胞对BTZ/ADM/Len的敏感性。这些结果表明NH₄⁺加速MM的进展并诱导复发。

C. freundii通过表达脱氨酶增加NH₄⁺的产生

研究者下一步探究了C. freundii在MM过程中产生NH₄⁺的分子机制。通过检查NCBI数据库中的C. freundii参考基因组，发现C. freundii中存在9个脱氨酶编码基因，其中只有两个基因（end和add）被转录表达。end基因敲除菌株（CFr-end^del）NH₄⁺生成减少，不能促进了MM的进展。由于补充NH₄⁺后BTZ抑瘤作用消失，因此NH₄⁺生成的减少与CFr-end^del不能促进MM进展以及BTZ的耐药有关。这些结果表明，肠道中C. freundii通过表达end基因而产生大量的NH₄⁺。

NH₄⁺通过稳定NEK2诱导对BTZ的耐药性

据报道，NH₄⁺的两种转运体由NKCC1和NKCC2两个基因编码。研究者发现只有NKCC1（又名:SLC12A2）在ARP1和H929细胞中表达，MM患者中也观察到较高的SLC12A2，因此构建SLC12A2敲除小鼠，发现SLC12A2的缺失降低了NH₄⁺的摄取，诱导了ARP1细胞的凋亡。此外还发现SLC12A2缺失显著下调NEK2。之前报道NEK2是一个关键的染色体不稳定性（CIN）基因，主要通过激活外排药物泵诱导耐药。研究者发现随着NH₄⁺治疗时间的增加，ARP1和H929细胞中NEK2蛋白水平逐渐升高。这些结果表明，SLC12A2和NEK2对于促进MM的进展和诱导MM对BTZ的耐药性具有重要作用。

NH₄⁺增强NEK2乙酰化并降低NEK2泛素化

之前报道过甘氨酸可以促进MM增殖和耐药，研究者前期发现可以通过在培养基中加入多种氨基酸（如甘氨酸和谷氨酰胺）来补充NH₄⁺。用一定浓度的甘氨酸或谷氨酰胺处理ARP1和H929细胞，发现NEK2随着甘氨酸或谷氨酰胺剂量的增加而逐渐上调。再用NH₄Cl、甘氨酸或谷氨酰胺处理，发现NEK2乙酰化水平升高，泛素化水平降低。以上结果表明NH₄⁺以及一些由氨参与合成的氨基酸增强NEK2乙酰化并降低NEK2泛素化。

速尿钠抑制NH₄⁺摄入可恢复BTZ对MM细胞的治疗作用

在确定SLC12A2是介导MM细胞摄取NH₄⁺的关键跨膜转运蛋白后，研究者又探究了靶向SLC12A2治疗MM复发的潜力，观察到MM患者接受Fus（一种已知的利尿剂）治疗有显著的临床疗效。在ARP1和H929细胞培养基中加入Fus，发现Fus可以剂量依赖性的方式下调细胞中SLC12A2的表达，ARP1和H929细胞摄取氨减少，可恢复BTZ对MM细胞的治疗作用。

补充益生菌可降低MM对BTZ的耐药性

为了寻找解决MM耐药的其他策略，研究者测试了之前描述的丁酸梭菌（C. butyricum）的作用，采用单一丁酸梭菌和三重益生菌（TPro；即丁酸梭菌、肠系膜芽孢杆菌和粪链球菌）灌胃定植，发现丁酸梭菌和三重益生菌可降低MM对BTZ的耐药性。

本研究发现MM患者中氮循环菌株C. freundii富集，它可以通过表达脱氨酶而产生大量氨，氨再借助SLC12A2进入血液循环到达骨髓瘤细胞，通过三羧酸循环生成多种氨基酸，产生的氨基酸作用于MM细胞中NEK2蛋白上的乙酰化位点，使NEK2乙酰化增强，泛素化减弱，促进MM发展以及MM对BTZ的耐药性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2023.11.019IF: 27.7 Q1 B1

撰稿 | 陈蓦珊

编辑 | 顾韫慧

参考文献：

1.Jian X, Zhu Y, Ouyang J, et al. Alterations of gut microbiome accelerate multiple myeloma progression by increasing the relative abundances of nitrogen-recycling bacteria. Microbiome. 2020;8(1):74.

2.Zhu Y, Jian X, Chen S, et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 2024;36(1):159-175.